茶皂素在刺參苗期對玻璃海鞘殺除效果的研究

韓莎 李成林 胡煒 趙斌 姚琳琳 王琦

(山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104)

近年來，隨著我國刺參養(yǎng)殖產業(yè)的高速發(fā)展，養(yǎng)殖敵害問題日趨突出[1-2]，一定程度上影響了產業(yè)的高效健康發(fā)展，如何有效防控敵害生物已成為困擾刺參養(yǎng)殖者的問題。玻璃海鞘(Cionaintestinalis)作為刺參育苗系統(tǒng)中常見的危害較大的敵害生物，不僅與刺參爭奪生活空間和餌料，而且會消耗水體中的溶解氧并排泄大量代謝物，從而抑制刺參的生長，影響刺參苗種培育的產量和質量[3]。一直以來，清除玻璃海鞘的首選做法是采用人工分揀，但傳統(tǒng)方式不僅費工費時費力，而且很難清除干凈，在操作過程中還極易引起參苗的應激反應，從而影響刺參苗種的正常攝食和生長。目前在刺參苗期生產中有效防控及清除玻璃海鞘的技術和方法仍然不多，尤其是能夠有效殺除玻璃海鞘又對刺參無明顯不良影響的綠色藥物尚不多見。

茶皂素(tea saponin)又名茶皂苷，是從山茶屬(Cameuia)植物中提取的純天然活性物質，尤其在茶籽中含量最多。已有研究證實，茶皂素在農業(yè)生產上可作為清塘劑、殺蟲劑、生長調節(jié)劑、抗應激劑等[4-5]，其效果優(yōu)良，對環(huán)境友好。目前尚未見采用茶皂素殺除玻璃海鞘的研究報道。本試驗旨在研究茶皂素對玻璃海鞘的殺除效果，探究最適殺除質量濃度和最佳作用時間，以加快有效殺除玻璃海鞘綠色藥物的研究開發(fā)，為刺參苗期有效防控和清除玻璃海鞘提供理論依據(jù)和技術參考，推進刺參工廠化育苗和養(yǎng)殖生產的高效綠色發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用藥品為市購的天然高純度茶皂素(即茶籽粉)，實驗室用，呈淺棕色，粉末狀，茶皂素有效含量(質量分數(shù))為80%。

附有玻璃海鞘和刺參苗種的波紋板框采集于山東省海洋生物研究院種質資源中心鰲山試驗基地。玻璃海鞘個體直徑5～12 mm，參苗規(guī)格為(0.30±0.08)g。將附有參苗及玻璃海鞘的波紋板置于0.2 m3的玻璃鋼水槽中，24 h充氣，待刺參苗種適應48 h后進行試驗。試驗海水為經過沙濾的天然海水，水溫24.8～25.0 ℃，鹽度33.2，pH為8.3，DO不低于6.2 mg/L。

1.2 試驗設計

試驗在60 L整理箱中進行，每個整理箱中放置附有50個玻璃海鞘和50頭刺參苗的波紋板1枚。將茶皂素粉末溶解于海水中配制成溶液，設置茶皂素質量濃度分別為5、10、20、30、40、50、60 mg/L的7個試驗組，每組設3個平行，分別于試驗開始后1、2、3、6、12 h觀測玻璃海鞘的脫落及死亡情況，以及參苗體表、肉刺的變化和附著活動情況。試驗結束后，將參苗轉移到注有新鮮海水的整理箱中，觀察并統(tǒng)計其恢復和活動情況。

1.3 試驗結果判定標準

玻璃海鞘死亡判定標準：水孔關閉，對外界刺激無反應，背囊褶皺、無彈性，內臟呈黃色、渾濁狀，轉移到新鮮海水中無法恢復。刺參恢復狀態(tài)判定標準：初步復蘇的刺參活力較差，受到外界刺激時有收縮反應，附著力較弱，分布于整理箱底部，不活動；完全復蘇的刺參活力正常，附著力較強，分布并附著于波紋板或者容器壁上，呈自由爬行活動狀態(tài)。

玻璃海鞘死亡率和刺參損傷率按下式計算。

死亡率(%)=死亡的玻璃海鞘數(shù)/玻璃海鞘總數(shù)×100

(1)

損傷率(%)=化皮的參苗數(shù)/參苗總數(shù)×100

(2)

2 結果

2.1 茶皂素對玻璃海鞘的作用效果

試驗結果表明，茶皂素對玻璃海鞘具有致死作用。當加入茶皂素溶液后，玻璃海鞘逐漸向內部用力收縮，身體緊縮、變小，出水口緊閉，放入新鮮海水中恢復一段時間后能夠恢復正常狀態(tài)。但隨著茶皂素質量濃度的提高，玻璃海鞘出水孔緩慢張開，水孔閉合節(jié)奏變慢，與正常狀態(tài)明顯不同。在藥物作用下，其出水孔逐漸伸長并保持張開的狀態(tài)，人為刺激無閉合反應。同時發(fā)現(xiàn)，死亡玻璃海鞘的背囊褶皺、無彈性，出水孔處于張開狀態(tài)，內臟團緊縮，呈黃色渾濁狀，對人為刺激毫無反應，放入新鮮海水中亦不能恢復到正常狀態(tài)。

2.2 不同質量濃度茶皂素對玻璃海鞘的殺除效果

不同質量濃度茶皂素溶液對玻璃海鞘的殺除效果見表1。試驗結果顯示，5、10、20 mg/L質量濃度組在藥浴12 h后玻璃海鞘的殺除率分別為32.3%、67.7%、83.3%。30 mg/L組在藥浴3 h后，玻璃海鞘的殺除率為98.3%，藥浴6 h殺除率可達100%。40 mg/L組在藥浴2 h后，玻璃海鞘的殺除率為99.7%，藥浴3 h時殺除率可達到100%。50、60 mg/L組藥浴2 h，玻璃海鞘的殺除率即可達到100%，其中60 mg/L組在藥浴1 h后，玻璃海鞘的殺除率可達97.7%。

表1 不同質量濃度茶皂素對玻璃海鞘的殺除率

2.3 茶皂素對刺參的毒性影響

刺參苗種在質量濃度為5～60 mg/L的茶皂素溶液中藥浴，6 h內均活力正常(見表2)，其棘刺無收縮，身體自由伸展，無明顯異常，藥浴12 h后則出現(xiàn)不同程度的身體疲軟、棘刺收縮現(xiàn)象，其中50、60 mg/L試驗組刺參在藥浴8 h后出現(xiàn)輕度化皮現(xiàn)象，12 h時刺參的損傷率分別為6.7%和13.3%。藥浴完成后，將刺參放入新鮮海水中，質量濃度5～40 mg/L試驗組的刺參在12 h后即可恢復到正常狀態(tài)，其棘刺恢復正常，無化皮、吐腸等不良現(xiàn)象，50、60 mg/L試驗組中有化皮損傷的刺參也未出現(xiàn)死亡，放入新鮮海水中經過一段時間能夠恢復到正常狀態(tài)。

表2 茶皂素對刺參的毒性影響

3 討論

作為1種天然藥物，茶皂素在環(huán)境中易降解，對人畜安全，口服無毒，在水產上也有根據(jù)其生物活性開發(fā)出的具有養(yǎng)殖保護[5]、促進生長[6]、病害防治[7]等功能的產品。已有研究表明，茶皂素對細菌和某些真菌有顯著的抑制作用，還可以防治對蝦黑鰓病，控制寄生蟲，對一些有害生物如福壽螺等螺類[8-9]、雜魚類也有一定的毒殺效果。茶皂素對福壽螺卵的孵化有較強抑制作用，對幼螺也有極強的毒殺作用，用質量濃度為2.5 mg/L的茶皂素溶液浸浴3 d，幼螺死亡率達100%，但茶皂素對成螺作用效果較差。本研究表明，茶皂素在刺參苗期對玻璃海鞘殺滅效果良好，分別用30、40 mg/L的茶皂素溶液藥浴6 h、3 h，用50、60 mg/L的茶皂素溶液藥浴2 h，玻璃海鞘的殺除率均可達100%。目前，茶皂素的生物活性及其毒殺作用機理尚不完全清楚，從已有的研究推斷，它是通過改變細胞膜的通透性而使細胞質外滲，即對動物血紅細胞具有溶血作用是其毒性的原因[4,10]，這可能也是茶皂素殺除玻璃海鞘的作用機制之一，具體原因有待進一步研究證實。研究結果可為有效控制玻璃海鞘的生存與繁殖，探明茶皂素活性物質作用機理及綠色藥物的研制開發(fā)提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，刺參對茶皂素有較好的適應性。雖然茶皂素有一定的毒害作用，但刺參敏感性較差，用低濃度的茶皂素短時間浸浴對刺參無明顯不良作用，而在高濃度的茶皂素溶液中浸浴8 h后刺參出現(xiàn)輕度不適現(xiàn)象，但放入新鮮海水中一段時間后也能夠恢復正常狀態(tài)。作為1種優(yōu)良的植物源表面活性劑，茶皂素具有良好的濕潤和懸浮能力[11]，高濃度溶液濕潤展布性能較好，易在參苗體表形成一層藥膜，一定程度上阻礙了刺參的呼吸活動。推測這可能是長時間浸浴后刺參出現(xiàn)不同程度身體疲軟、棘刺收縮甚至輕度化皮等現(xiàn)象的原因。

綜合考慮茶皂素對玻璃海鞘殺除效果以及對刺參苗種的影響，選用質量濃度為30～40 mg/L的茶皂素溶液藥浴2～3 h對玻璃海鞘具有很好的殺除效果，殺除率接近100%，同時對刺參苗種無明顯的毒副作用，不會產生不良應激反應，參苗在重新放入新鮮海水中后很快恢復到正常狀態(tài)。基于對生態(tài)環(huán)境的保護，我國在漁業(yè)生產上大力推行綠色養(yǎng)殖，化學藥品的使用正逐步規(guī)范化，一些藥品被限制甚至禁用，而茶皂素經濟高效、綠色安全、生態(tài)環(huán)保，具有較好的生產應用效果。因此，在刺參育苗和工廠化養(yǎng)殖中采用適當質量濃度的茶皂素殺除玻璃海鞘，對刺參育苗和工廠化養(yǎng)殖中敵害生物的有效防控以及綠色環(huán)保具有積極的意義。