色譜指紋圖譜在中藥提取物及其牙膏質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究

李 平 陳敏珊 陶 麗 肖俊芳

(廣州薇美姿實業(yè)有限公司,廣東 廣州 510665)

1 引言

近年來，具有宣稱添加中藥、草本成分的口腔護(hù)理產(chǎn)品越來越受到消費者的歡迎。然而，對于生產(chǎn)廠家來說，中藥提取物原料的質(zhì)量控制一直是一個重點問題，也是難點問題。中藥提取物質(zhì)量控制的關(guān)鍵點在于保證其功效，因此需要對提取物的各組分和含量進(jìn)行監(jiān)控。中藥材的種類繁多，成分復(fù)雜，產(chǎn)地分散，類同品、代用品不斷，加之生長環(huán)境、采收季節(jié)、加工炮制方法不同及制劑生產(chǎn)工藝的因素，造成其內(nèi)在質(zhì)量即所含化學(xué)成分及臨床療效的差異。中藥是依靠其所含的多種化學(xué)成分發(fā)揮綜合的作用，這是與化學(xué)合成藥最根本的區(qū)別。因此，模仿化學(xué)藥品的質(zhì)量控制模式，選定一兩個有效成分、活性成分或指標(biāo)成分進(jìn)行鑒別和含量測定，不能有效地評價中藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣。因為中藥是多成分、多靶點在起作用，不同于化學(xué)藥品的單一成分、單一靶點，這是中藥與化學(xué)合成藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的根本區(qū)別[1,2]。

在建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的過程中，應(yīng)充分考慮到中藥的特性，結(jié)合系統(tǒng)論和控制論的理論，進(jìn)行綜合評價。中藥指紋圖譜技術(shù)是一個非常合理的切入點。中藥指紋圖譜是目前國際上認(rèn)可的一種中藥質(zhì)量評價模式，它也是符合中藥整體性使用特點的質(zhì)量控制手段。國家食品藥品監(jiān)督管理局已在中藥注射劑領(lǐng)域開始實施指紋圖譜研究，對中藥注射劑的藥材、中間體和成藥要求推廣執(zhí)行指紋圖譜質(zhì)量控制模式[3,4]。本研究以救必應(yīng)提取物為例探討色譜指紋圖譜在中藥提取物質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

2 材料和方法

2.1材料與試劑

本實驗所用救必應(yīng)提取物由供應(yīng)商采購不同產(chǎn)地救必應(yīng)藥材，使用統(tǒng)一的提取工藝提取所得，所有藥材均為鐵冬青干燥樹皮。

紫丁香苷對照品(純度99.9%)、長梗冬青苷對照品(純度89.3%)(中國食品藥品檢定研究院)；色譜純甲醇(TEDIA，USA)；色譜純乙腈(TEDIA，USA)；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli ATCC25922)、牙齦卟啉單包菌(Porphyromonasgingivalis ATCC33277)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus AS1.2686)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans ATCC700610)，均購自于廣東省微生物研究所。

斜面培養(yǎng)基：

需氧細(xì)菌：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，厭氧細(xì)菌：腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHA)；

實驗培養(yǎng)基：

需氧細(xì)菌：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，厭氧細(xì)菌：腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHIB)。

2.2儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-class超高效液相色譜系統(tǒng)(TUV檢測器，Empower3色譜軟件)(Waters，USA)；超聲波清洗機(SB-4200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)；超純水器(UPC-I-5T，四川優(yōu)普超純科技有限公司)；分析天平(AR224CN，Ohaus，USA)；離心機(UNIVERSAL320，Hettich，Germany)。

生物安全柜(HR40-II-A2，青島海爾特種電器有限公司)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LT-CPS38D，立德泰勀(上海)科學(xué)儀器有限公司)、微量移液器(Eppendorf，Germany)、漩渦混合器(JXW-80A，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Cellstar，Greiner，Germany)、酶標(biāo)儀(RT2100-C，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)、厭氧/微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)(LAB JAR，廣州雷得生物技術(shù)有限公司)。

2.3方法

2.3.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；流動性A：超純水；流動性B：乙腈；梯度洗脫程序見表1；流速：0.3mL/min；檢測波長：210nm；進(jìn)樣量：1μL；理論塔板數(shù)以紫丁香苷峰計算不應(yīng)低于3000。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.3.2對照品溶液的制備

精確稱取紫丁香苷和長梗冬青苷對照品適量，置于10mL棕色容量瓶中，使用50%甲醇溶液溶解、定容，制得含0.1g/L紫丁香苷和0.3g/L長梗冬青苷的溶液，使用0.22μm有機系微孔濾膜過濾，備用。

2.3.3供試品溶液的制備

精密稱取救必應(yīng)提取物0.1000g，置于50mL具塞錐形瓶中，加入25mL50%甲醇溶液，稱重。超聲提取30min(40KHz，400W)，再次稱重，用50%甲醇溶液補足失重。10000g離心5min，取上清液過0.22μm有機系微孔濾膜備用。

2.3.4樣品測定

按2.3.3條件制備不同產(chǎn)地來源救必應(yīng)提取物溶液，按2.3.1色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。

2.3.5最小抑菌濃度(MIC)測定

參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)頒布的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)(第9版)[5]，對各抗菌劑及牙膏產(chǎn)品進(jìn)行最小抑菌濃度測定。厭氧菌采用厭氧罐進(jìn)行培養(yǎng)。

3 結(jié)果與討論

3.1精密度實驗

取救必應(yīng)提取物樣品(IRC-1)供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，相似度結(jié)果均在0.99以上，各色譜峰峰面積的RSD值小于2.0%。

3.2穩(wěn)定性實驗

取救必應(yīng)提取物樣品(IRC-1)供試液，分別在0、2、4、8、12、24h按2.3.1色譜條件進(jìn)行測定，各主要色譜峰保留時間RSD<1.0%，峰面積RSD<2.0%。結(jié)果表明，救必應(yīng)提取物供試液在室溫條件24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3重復(fù)性實驗

2) 對景手法在突出所對主景的同時將物質(zhì)空間與民眾生活緊密相連，營造出場所感與歸屬感，吸引人們用腳步丈量、感知城市，也為民眾在公共空間駐足、交往提供了可能，城市生活因此而充滿生機與活力.

精密稱取同一救必應(yīng)提取物樣品(IRC-1)6份，按2.3.3方法制備供試液，按2.3.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算出相似度在均在0.99以上，各主要色譜峰保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，表明重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

3.4救必應(yīng)UPLC指紋圖譜的特征峰確定

取10批救必應(yīng)提取物樣品，按2.3.3方法制備供試液，按2.3.1色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將10批救必應(yīng)提取物樣品指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》軟件進(jìn)行分析，時間窗0.1，中位數(shù)法，以3號峰(紫丁香苷)和9號峰(長梗冬青苷)為參照峰經(jīng)多點校正后自動匹配后生成救必應(yīng)提取物的對照指紋圖譜，并確定了11個共有峰，救必應(yīng)提取物對照指紋圖譜(共有模式)見圖1。

圖1 救必應(yīng)提取物UPLC對照指紋圖譜

3.5不同救必應(yīng)藥粉的指紋圖譜相似度評價

將10批救必應(yīng)提取物樣品指紋圖譜的AIA數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》軟件，計算各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜R的相似度，各救必應(yīng)提取物樣品疊加指紋圖譜見圖2，相似度計算結(jié)果見表2。由表2可知，除第5、8、9批救必應(yīng)提取物樣品相似度較低外，其他批次樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.947～0.978之間。

表2 與共有模式比較的各樣品相似度評價

圖2 救必應(yīng)提取物UPLC指紋圖譜

3.6不同批次救必應(yīng)提取物牙膏抗菌性能評價

將10批救必應(yīng)提取物分別加入到一個相同的基礎(chǔ)牙膏配方體系中，然后對牙膏的抗菌性能(MIC值)進(jìn)行考察。測試結(jié)果見表3。

表3 不同批次救必應(yīng)提取物所做牙膏的MIC值(ppm)

從表3可以看出救必應(yīng)提取物編號為IRC5、IRC8、IRC9所做的牙膏的最低抑菌濃度值較大，說明其抑菌效果較其他編號的牙膏差。編號為IRC1、IRC2、IRC3、IRC4、IRC6、IRC7、IRC10救必應(yīng)提取物所做的牙膏其MIC值均較接近。由表2的相似度評價結(jié)果可知，IRC1、IRC2、IRC3、IRC4、IRC6、IRC7、IRC10救必應(yīng)提取物相似度均較高，說明其成分組成較為相似，這與牙膏的抗菌性能測定結(jié)果是相一致的。

3.7不同批次救必應(yīng)提取物牙膏的穩(wěn)定性

將不同批次救必應(yīng)提取物放入同一個牙膏配方中進(jìn)行穩(wěn)定性考察。表4的結(jié)果表明，除編號為IRC5、IRC8、IRC9救必應(yīng)提取物所在牙膏外，其余各牙膏的稠度、pH值穩(wěn)定，膏體沒有出油、返粗、脫殼等現(xiàn)象，且香味、色澤、穩(wěn)定性正常，各項質(zhì)量指標(biāo)全部符合國標(biāo)GB8372-2008的要求。

3.8討論

本研究以救必應(yīng)提取物為例，在色譜測試條件上經(jīng)過大量試驗，建立了10批不同產(chǎn)地救必應(yīng)提取物的UPLC指紋圖譜。測試結(jié)果表明，9批救必應(yīng)提取物的UPLC指紋圖譜較為相似，說明各地救必應(yīng)藥材中化學(xué)成分種類較為一致。但是，不同樣品之間同一色譜峰面積相差較大，說明各產(chǎn)地救必應(yīng)藥材之間化學(xué)成分含量比例差異較大。這可能是由于不同生長環(huán)境的影響而導(dǎo)致的。另一方面，將不同批次的救必應(yīng)提取物應(yīng)用于牙膏中，測定其抑菌性能及其牙膏的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，相似度高的救必應(yīng)提取物所制作的牙膏的抗菌性能及穩(wěn)定性同樣趨于相似。

綜上，中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的可量化的鑒別手段，符合中藥整體性使用的特點。目前，其也是國際上認(rèn)可的一種中藥質(zhì)量評價模式。因此，在中藥提取物質(zhì)量控制方面引入色譜指紋圖譜作為評價手段，對提高產(chǎn)品的質(zhì)量保證產(chǎn)品功效具有重要的作用。