黃顙魚(♀)、長吻(♂)及其雜交F1代遺傳多樣性分析

王宏玉，武兆文，付東勇，蘇孟園，楊汶珊，唐榮葉，王 濤，尹紹武

(南京師范大學 海洋科學與工程學院，江蘇省特色水產育種與綠色高效養殖技術工程研究中心，江蘇 南京 210023)

微衛星DNA也稱簡單串聯重復序列(SSRs)，由非常短的串聯重復DNA片段組成，是廣泛分布于真核生物基因組中的一種中度重復序列[7]。微衛星DNA有著高突變率、中性、共顯性，及在真核基因組中普遍存在等特點[8]，相比于其他分子標記手段有著明顯的優勢，能成功地用于揭示群體遺傳分析[9]，進行種質資源及親緣關系的鑒定和遺傳連鎖圖譜繪制[10]。微衛星DNA在魚類中的應用進展非常快，到目前為止，魚類雜交后代的遺傳分析也都普遍使用微衛星DNA技術，已有學者對黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚(P.vachelli)(♂)[11]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(♀)×薩羅羅非魚(Sarotherodonmelanotheron)(♂)[12]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)(♀)×翹嘴鲌(Culteralburnus)(♂)[13]等進行親本與子代的分析。筆者采用微衛星分子標記技術，尋找能夠鑒定黃顙魚、長吻及雜交F1代3個群體的特異性微衛星分子標記并進行遺傳多樣性分析，在分子水平上探索雙親與子代的遺傳規律，為實現雜交鲿科魚類新品種選育提供基礎資料和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

使用上海捷瑞生物公司的細胞(組織)基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，取黃顙魚、長吻、雜交F1代的尾鰭各約0.5 g，進行DNA提取，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性與純度，置于冰箱-20 ℃保存，待使用時取出。

1.2.2 微衛星引物的篩選

表1 在3個群體中表達的12個微衛星位點的特征Tab.1 Features of 12 microsatellite loci expressed in 3 populations

1.2.3 PCR擴增

PCR擴增參照文獻[14]的設計。反應總體系為20 μL，包括：DNA模板1 μL，正、反引物各0.8 μL，滅菌水7.4 μL，2×Taq Master Mix 10 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；35個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，退火30 s(每個位點退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀中觀察是否有單一的條帶。將檢測到有單一條帶的產物上樣于ABI3500xl基因分析儀進行毛細管電泳，利用軟件GeneMapper 4.1分析微衛星位點的片段大小。

1.2.4 數據處理

數據處理參考文獻[15]。利用POPGENE 1.32分析微衛星位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳相似度、Nei氏遺傳距離；利用PIC-CALC計算多態信息含量值(PIC)。利用MEGA 5.0構建非加權組平均法3個群體的UPGMA的親緣關系樹。

2 結果與分析

2.1 有效引物篩選

自每個群體的32個DNA樣品中選取5個，用來驗證所篩選的20對引物，所得條帶見圖1。經驗證后共有12對能在黃顙魚、長吻及其雜交子代中擴增出清晰條帶(圖2)。其中雙堿基引物10個、三堿基引物1個、四堿基引物1個，產物大小211～310 bp，每種引物擴增出的多態性位點差別不大。

圖1 篩選出的能在3個群體中表達的引物Fig.1 Primers screened for expression in three populations前5個為黃顙魚，中間5個為長吻，后5個為雜交F1代.The first five bands are yellow catfish P.fulvidraco,the middle five ones are longsnout catfish L.longirostris,and the last five ones are hybrids F1.

圖2 同一引物在3個群體中的表達情況Fig.2 Expression of the same primer in three populationsa.雜交F1代；b.長吻；c.黃顙魚a.Hybrid F1;b.longsnout catfish L.longirostris;c.yellow catfish P.fulvidraco.

2.2 3個群體遺傳特性分析

雜交F1代的平均有效等位基因數為2.535，高于黃顙魚(2.382)和長吻(2.221)(表2)。黃顙魚的平均觀測雜合度(0.419)高于長吻的平均觀測雜合度(0.367)，而雜交F1代的平均有效觀測雜合度(0.604)也比雙親高。雜交F1代的平均多態信息含量為0.509，黃顙魚為0.420、長吻為0.365。

表2 黃顙魚、長吻、雜交F1代的遺傳多樣性參數Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

表2 黃顙魚、長吻、雜交F1代的遺傳多樣性參數Tab.2 Parameters of genetic diversity in yellow catfish P.fulvidraco,longsnout catfish L.longirostris and hybrid F1

位點Locus黃顙魚P.fulvidraco長吻L.longirostris雜交F1代HybridF1NaNeHoHePICNaNeHoHePICNaNeHoHePICL1931.0990.0940.0920.08811.0000.0000.0000.00022.0001.0000.5080.375L2521.9520.8440.4960.36941.1000.0630.0920.08993.7440.8750.7450.698L3353.7790.7810.7470.68721.9090.5310.4840.36342.2530.1250.5650.458L35106.0770.5940.8490.81765.1070.5940.8170.775113.5620.9690.7310.703L3972.4980.2500.6090.57784.3570.7810.7830.73632.4300.2190.5980.501L4151.8430.0630.4650.43032.1810.6560.5500.61821.9980.9690.5070.375L4332.1810.8440.5500.45731.5340.3130.3540.45742.4180.0940.5960.506L4431.2900.1880.2280.21021.0640.0000.0620.05932.2530.6560.5650.481L4572.7420.2190.6450.56811.0000.0000.0000.000132.9130.8750.6670.639L4762.1200.6250.5370.44421.1680.1560.1460.13742.1810.0310.5500.439L5432.0020.5310.5080.39084.1290.6560.7700.72232.7130.7190.6410.560L7711.0000.0000.0000.0004.2.1010.6560.5320.42921.9520.7190.4960.369均值Mean4.5832.3820.4190.4770.4203.6672.2210.3670.3830.3655.0002.5350.6040.5970.509

注：Na.等位基因數；Ne.有效等位基因數；Ho.觀測雜合度；He.期望雜合度；PIC.多態信息含量.Note：Na.number of allele；Ne.number of effective allele；Ho.observed heterozygosity；He.expected heterozygosity；PIC.polymorphic information content.

2.3 群體間遺傳距離和遺傳系數分析

表3 3個群體的遺傳距離和遺傳相似系數Tab.3 Genetic distance and genetic similarity coefficient of three populations

基于Nei氏遺傳距離，用MGEA 5.0軟件構建的UPGMA樹顯示，雜交F1代與父本長吻親緣關系最近，先聚為一支，然后再與母本黃顙魚聚為一支(圖3)。

圖3 黃顙魚、長吻和雜交F1的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGAM molecular trees of yellow catfish P.fulvidraco,long-snout catfish L.longirostris and hybrid F1 based on genetic distance

3 討 論

3.1 3個群體的遺傳多樣性

生物的遺傳多樣性是評價生物資源狀況的一個重要依據[16]。微衛星DNA標記是進行物種親緣關系研究及遺傳多樣性分析的有效工具，是分子水平上研究遺傳多樣性的一個重要手段[17]。微衛星DNA憑借較高的突變率使得微衛星具有高度的遺傳多態性，在鑒定種群內的親緣關系以及近親自交程度等均有著較為普遍的應用[18]。彭濤等[19]曾利用12對湖鱘(Acipenserfulvescens)微衛星引物對小體鱘(A.ruthenus)、施氏鱘(A.schrenckii)、西伯利亞鱘(A.baeri)及3種鱘魚雜交后代的引物通用性進行研究，結果顯示，只有4對引物在6種鱘魚中表現出多態性，用來分析遺傳多樣性。唐江等[20]從50對石斑魚屬(Epinephelus)微衛星引物中篩出27對引物，用來分析鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)(♂)、云紋石斑魚(E.moara)(♀)及其雜交子一代云龍斑的遺傳性狀，最終有25對引物在子代中檢測出多態性。本試驗通過一步篩選，最終從20對引物中篩選出12對具有多態性位點，有效擴增率為60%。

有效等位基因數是基因純合度的倒數，反映了等位基因間的相互影響，可作為群體遺傳變異的一個指標[21]。根據12對有效擴增結果顯示，黃顙魚、長吻及雜交F1代的平均有效等位基因數為2.382、2.221、2.535。有效基因數的增加證明了在雜交子代保持較高的遺傳潛力。由表2可知，雜交F1代的平均觀測雜合度和平均期望雜合度為0.604、0.597，略高于母本黃顙魚(0.419、0.477)，明顯高于父本長吻(0.367、0.383)。雜合度又稱基因多樣性，是測量群體遺傳變異的最佳參數[22]。通過檢測位點上雜合子基因型占據該位點所有基因型的比例，能夠反映群體間的遺傳變異高低[23]。而且有效基因數、觀測雜合度、期望雜合度三者數值越大，基因豐富度就越高。雜交F1代的基因雜合度都高于雙親，基于等位基因變異有較高的遺傳多樣性，這是雜種優勢得以形成的重要遺傳物質基礎之一。以Botstein等[24]提出的用多態信息含量來衡量基因變異程度高低為依據，當多態信息含量≥0.5時為高度多態，0.25<多態信息含量<0.5時為中度多態，多態信息含量≤0.25時為低度多態。由表2可知，黃顙魚和長吻的多態信息含量為0.420和0.365，為中度多態，雜交F1代為0.509大于0.5為高度多態，雜交F1代的多態信息含量高于雙親。這個結果表明，在所篩選到的引物中，雜交F1代呈現出比親本高的變異程度，這與李景芬等[25]研究黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚(♂)得出的雜種一代基因變異程度比雙親高，DNA多態性豐富，以及在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)(♀)、菊黃東方鲀(T.flavidus)(♂)及其雜交子代遺傳分析結果顯示的子代遺傳多樣性高于雙親[26]的結論是一致的。這些都體現出雜交F1代較雙親的遺傳多樣性有所增加，具有一定的雜交優勢，可以有培育的潛力。

3.2 遺傳距離和遺傳相似指數

在以往的研究結果中不難發現，雜種優勢與遺傳距離存在著正相關性[12]，親本間遺傳差異越大，親緣關系越遠，其后代雜種優勢越明顯[14]。由Nei氏遺傳距離(表3)可知，黃顙魚和長吻存在著2.0316的雜交距離，說明雜交F1代應該具有一定的雜交優勢。UPGMA聚類分析結果表明，雜交F1代與父本長吻的遺傳距離(0.8551)小于與母本黃顙魚的遺傳距離(1.7271)，說明子代與父本的遺傳差異小于與母本的遺傳差異，與父本的親緣關系較近，從父本獲得更多的遺傳物質。

4 結 論