珍珠龍膽石斑魚血細胞發生的研究

湯綺桐，曹伏君，葉 寧

(廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088)

珍珠龍膽石斑魚(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)，又名龍虎斑或珍珠斑，是雄性龍膽石斑魚與雌性老虎斑雜交成的新品種石斑魚。珍珠龍膽石斑魚的肉質滑嫩鮮美，營養豐富，而且成長快速，個體大的體長可達50 cm。珍珠龍膽石斑魚具有食性廣、抗病能力強等優點。得益于海南育種研究人員的多年研究，珍珠龍膽石斑魚已經可以進行規模化養殖[1]。

目前，國內對于珍珠龍膽石斑魚的研究主要集中于養殖方式、生長發育情況、藥物等方面[2]，而對于其造血器官中的血細胞發生的研究相對較少。筆者對珍珠龍膽石斑魚血細胞的發生進行詳細研究，以期為魚類血細胞發生的研究提供更多的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗珍珠龍膽石斑魚購自湛江市榮成養殖場，共10尾，雌雄各半。購回后在室內養殖池內暫養1 d(曝氣24 h的自來水，室溫，充氣泵增氧，不投餌料)。試驗時選取健康狀況良好、身體無外傷的個體。

1.2 方法

1.2.1 造血器官印跡片、涂片制備

拭凈魚體表，剖開胸腹腔，將魚的頭腎、體腎、脾臟取出，在0.65%魚用生理鹽水中洗去表面血漬，然后用濾紙吸干，用刀片將每個器官分別作橫切、縱切4個斷面，每個斷面在潔凈載玻片上輕輕印5個印跡面。每尾魚各器官各作印跡片20張，待干后，瑞氏染液染色10 min，加入磷酸緩沖液浸泡10 min，用清水沖洗，晾干。中性樹脂封片。各組織分別剪碎作涂片10張。

1.2.2 血細胞計數與測量

分別取頭腎、體腎和脾臟各10張以上印片、涂片，每張印片、涂片隨機取5個視野，對各細胞系按其發生的不同階段進行形態描述，分類計數并計算百分比值。用Olympus BX51顯微鏡油鏡觀察，并選擇較好的圖片，在1392×1040像素下拍照，標尺為200 μm；任選各型細胞各20個進行長、短徑測定，作統計處理。

1.2.3 血細胞發育階段的劃分

參照《野生動物血液細胞學圖譜》[3]的標準劃分。

2 結 果

2.1 各類血細胞的發育過程

魚類血細胞的發育一般會被劃分為原始、幼稚、成熟3個階段[4-5]。

2.1.1 紅細胞系

原紅細胞(圖1a)：原紅細胞的胞體呈圓形或橢圓形，細胞體比較大，細胞質比較少，被染成深藍色。原紅細胞的細胞核很大，占細胞的大部分，位于細胞的中央或略偏于細胞的一側，核膜明顯，核仁清晰可見,細胞核內染色質被染成紫紅色，呈粗粒狀。細胞核周圍存在顏色較淺的淺紅色環核帶區。

幼紅細胞(圖1b～h)：細胞呈圓形或橢圓形，早幼紅細胞的細胞質顏色逐漸變淺，呈淺藍色或灰藍色，細胞質周圍有一條狹窄的深藍色環帶區。細胞核內染色質被染成紫紅色，核仁逐漸消失。晚幼紅細胞呈圓形或橢圓形，細胞質染成桔黃色或桔紅色，細胞核更致密。

紅細胞(圖1i～j)：紅細胞呈圓形或橢圓形，細胞質被染成桔紅色。細胞體外表面光滑，無胞突，細胞核位于細胞的中央，或稍微偏于細胞的一側，呈圓形或橢圓形，染色質致密成塊，呈深紫紅色，沿細胞核的周圍或者中央均勻分布。衰老紅細胞呈不規則圓形或橢圓形，此時的體積與正常紅細胞相比，體積更小，細胞核更濃縮，染色更深。

圖1 珍珠龍膽石斑魚紅細胞系Fig.1 Erythroid lineage in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原紅細胞;b.早幼紅細胞—早期;c.早幼紅細胞—晚期;d.晚幼紅細胞;e～h.早期早幼紅細胞的有絲分裂相.i.紅細胞;j.衰老紅細胞.a.proerythroblast;b.basophilic erythroblast in early stage;c.basophilic erythroblast in late stage;d.later acidophilic erythroblast;e—h.mitotic division of basophilic erythroblast in early stage;i.erythrocyte;j.aging erythrocyte.

2.1.2 粒細胞系

原粒細胞(圖2a):原粒細胞的細胞體呈圓形或卵圓形，細胞質量少，染成藍色，著色均勻，透明無顆粒。核質比大，約占細胞的2/3～4/5。原粒細胞的細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞的中央，或稍微偏于細胞的一側，細胞核染色質被染成淺紫紅色，呈細沙粒狀，均勻分布在細胞核內，核仁被染成淡藍色，明顯可見。

早幼粒細胞(圖2b):細胞體呈圓形或卵圓形，細胞質呈淺藍色，細胞質中有淺紫紅色嗜天青顆粒出現。早幼粒細胞的細胞核呈橢圓形，偏于細胞的一側，約占整個細胞的1/3～1/2。早幼粒細胞的細胞核內染色質較深，核仁不清晰，或者完全消失。

中幼粒細胞：從中幼粒細胞開始，細胞內的嗜天青顆粒的數量逐漸減少，特殊性顆粒含量增多，可根據特殊性顆粒明顯分辨出兩種不同的粒細胞。

(1)中性中幼粒細胞(圖2c)：細胞呈圓形或橢圓形，核質比小。中性中幼粒細胞的細胞核呈圓形或橢圓形，約占整個細胞的1/3～1/2，常偏于細胞的一側，細胞核內染色質濃聚，核仁消失不見。胞質含量較多，被染成淺藍色或淺藍微紅色，細胞質內有許多特異性顆粒，顆粒的著色很淺，經過染色顯示為微黃色或者淡粉紅色。

(2)嗜酸性中幼粒細胞(圖2d)：嗜酸性中幼粒細胞的體積比中性中幼粒細胞小，細胞呈圓形或近圓形，核質比大，約為1/2，細胞核常常偏于細胞的一側，染色質被染成深紫紅色。嗜酸性中幼粒細胞的細胞質比早幼粒細胞的細胞質染色更淺，顯示淡藍色，質里含有許多紅色嗜酸性顆粒，顆粒大量分布，導致整個細胞呈紅藍過渡色或紅色。

晚幼粒細胞:

(1)中性晚幼粒細胞(圖2e)：與中幼粒細胞相比，中性晚幼粒細胞的體積更小，胞體呈圓形或橢圓形，核質比大，約為1/2，中性晚幼粒細胞的細胞核呈橢圓形，或核的一側凹陷至腎形，細胞核內染色質致密成塊，沒有核仁。中性晚幼粒細胞的細胞質呈淺藍或淺粉紅色，細胞質里含有大量嗜中性顆粒，顆粒顯淡黃色或無色。

(2)嗜酸性晚幼粒細胞(圖2f)：嗜酸性晚幼粒細胞胞體呈圓形或近圓形，與嗜酸性中幼粒細胞相比，嗜酸性晚幼粒細胞的體積更小，細胞核呈圓形或橢圓形，核質比較小，小于細胞體積的1/2，細胞核位于細胞的一側，細胞核內的染色質濃縮，被染成深紫紅色，細胞質被染成紅色，整個細胞質中充滿特異性嗜酸性顆粒。

成熟粒細胞:

(1)中性粒細胞(圖2g～h)：細胞呈圓形或橢圓形，核質比小，細胞核的體積小于1/3，細胞核形狀多樣，呈橢圓形、凹陷成腎形、桿狀或者分2～5葉，細胞核常常位于細胞的一側，或者與細胞質膜相切，細胞核內的染色質濃縮，呈暗紫紅色，無核仁，中性粒細胞的細胞質被染成淺粉紅色，含有大量特異性的嗜中性顆粒。

(2)嗜酸性粒細胞(圖2i)：嗜酸性粒細胞和嗜酸性晚幼粒細胞的細胞形態類似，但與嗜酸性晚幼粒細胞相比，嗜酸性粒細胞的細胞體積更小，細胞核更加偏位。

圖2 珍珠龍膽石斑魚粒細胞系Fig.2 Granuloid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原粒細胞;b.早幼粒細胞;c.中性中幼粒細胞;d.嗜酸性中幼粒細胞;e.中性晚幼粒細胞;f.嗜酸性晚幼粒細胞;g.中性粒細胞;h.中性粒細胞;i.嗜酸性粒細胞.a.progranuloblast;b.young progranulocyte;c.neutrophilic progranulocyte;d.eosinophilic progranulocyte;e.neutrophilicmetagranulocyte;f.eosinophilic metagranulocyte;g.neutrophilic granulocyte;h.neutrophilic granulocyte;i.eosinophilic granulocyte.

2.1.3 單核細胞系

原單核細胞(圖3a):細胞體積很大，呈圓形、橢圓形或不規則形，細胞質呈淺藍色。核質比較大，約占1/2以上，細胞核呈不規則橢圓形，常偏于細胞的一側，原單核細胞核內染色質是所有原血細胞中最細的，染成淺紫紅色，呈細絲網狀，走向與細胞核的長軸平行，核仁明顯可見。

幼單核細胞(圖3b):細胞呈圓形或不規則橢圓形，與原單核細胞相比，體積更小。幼單核細胞的細胞質呈灰藍色，可以看到有一些大小不一的空泡，有的胞漿內可以看見少量細小嗜天青顆粒出現。細胞核呈橢圓形或不規則形，核質比較大，約占1/2，細胞核內染色質呈細絲網狀，核仁模糊不清，至逐漸消失。

單核細胞(圖3c):細胞呈圓形或橢圓形，細胞質被染成淺藍色，量多。單核細胞的細胞核呈不規則圓形或橢圓形，核質比較大，約占1/3～1/2，細胞核內的染色質松散，呈淺紫紅色。細胞質里可以看到有細小嗜天青顆粒和一些大小不一的空泡。

圖3 珍珠龍膽石斑魚單核細胞系Fig.3 Monocytoid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原單核細胞;b.幼單核細胞;c.單核細胞;d.巨噬細胞—早期;e.巨噬細胞;f.巨噬細胞.a.promonoblast;b.young promonocyte;c.monocyte;d.macrophage in early stage;e.macrophage;f.macrophage.

巨噬細胞(圖3d～f):細胞體積大，細胞質中許多空泡，巨噬細胞的細胞核染色質著色淺，核邊界不清晰，靠近細胞邊緣，可見有吞噬的無核紅細胞(胞質小體)及其他吞噬物在細胞質內。

2.1.4 淋巴細胞系

原淋巴細胞(圖4a):細胞體呈圓形，細胞質量少，染成深藍色。幼淋巴細胞的細胞核很大，呈圓形或橢圓形，細胞核一般位于細胞中央，有時會有偏位，染色質被染成紫紅色，呈粗網狀，核仁清晰，細胞核與細胞質的界限十分明顯。細胞核周圍的細胞質染色略淡，形成顏色較淺的核周淡染帶。細胞膜比較平整，偶爾有胞突。

幼淋巴細胞(圖4b):細胞體呈圓形或近圓形，可見鈍形胞突，幼淋巴細胞的細胞質含量很少，染成藍色或淺藍色，有嗜天青顆粒出現。幼淋巴細胞的細胞核呈圓形，或稍有凹陷，染色質被染成紫紅色，呈粗網狀，核仁不清晰，或消失。

淋巴細胞(圖4c～g):淋巴細胞根據大小的不同可以分為小淋巴細胞、中淋巴細胞和大淋巴細胞。

圖4 珍珠龍膽石斑魚單核細胞系Fig.4 Lymphoid lineages in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.原淋巴細胞;b.幼淋巴細胞;c.大淋巴細胞;d.中淋巴細胞;e.小淋巴細胞;f.小淋巴細胞;g.分裂的淋巴細胞.a.lymphoblast;b.prolymphocyte;c.large lymphocyte;d.medium lymphocyte;e.small lymphocyte;f.small lymphocyte;g.mitotic division of lymphocyte.

小淋巴細胞的個體很小，細胞體呈圓形或類圓形，細胞質被染成淺藍色，細胞質的含量十分少，常常可以見到較短的胞突，或細胞質凹陷，細胞核染成暗紫紅色，染色質致密成塊，無核仁。

大淋巴細胞個體比較大，細胞體呈類圓形，有胞突，細胞質染成藍色或淺藍色，細胞質的含量比小淋巴細胞的多，細胞核呈圓形或腎形，與小淋巴細胞相比，大淋巴細胞染色質更細而松散，染色呈紫紅色，比小淋巴細胞稍淡。

2.1.5 其他細胞

血栓細胞(圖5a):細胞體積比淋巴細胞的體積小，呈圓形、橢圓形或紡錘形，核質比大。血栓細胞的細胞核呈圓形或橢圓形，被染成暗紫紅色，與淋巴細胞的細胞核相比，染色更深，細胞質十分少或圍繞細胞核零星分布，有的血栓細胞甚至成裸核狀，細胞質邊界模糊，呈淺藍色。

網狀細胞(圖5b):細胞胞體很大，呈類圓形，不規則，在細胞膜上可以看到有許多突起的偽足。網狀細胞的細胞核大，呈橢圓形或類圓形，染色質呈細沙粒狀。細胞質呈淺藍色，染色不均勻，常可見淋巴細胞、粒細胞、血栓細胞等細胞鑲嵌在網狀細胞的細胞質邊緣。

圖5 珍珠龍膽石斑魚其他血細胞Fig.5 Other cells in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀a.血栓細胞;b.網狀細胞.a.thrombocyte;b.reticulocyte.

2.2 血細胞的計數與測量

2.2.1 血細胞計數

在頭腎和體腎的印片、涂片上可以觀察到原紅細胞，而在脾臟中未觀察到原紅細胞，說明頭腎和體腎是珍珠龍膽石斑魚紅細胞的主要發生器官。同樣，在頭腎和體腎內可以觀察到原粒細胞，而在脾臟涂片上未觀察到原粒細胞，說明頭腎和體腎可能是珍珠龍膽石斑魚粒細胞的主要發生器官，其他兩種原始細胞(原單核細胞、原淋巴細胞)均可在頭腎、體腎、脾臟中觀察到，因此推斷頭腎、體腎、脾臟是其他兩種血細胞(原單核細胞、原淋巴細胞)發生的主要場所。因此，珍珠龍膽石斑魚最主要造血器官是頭腎(表1)。

2.2.2 血細胞測量

原紅細胞和幼紅細胞的細胞體大小變化不大，細胞從圓形(類圓形)逐漸變成橢圓形(近橢圓形)，原紅細胞的細胞體積約為紅細胞的2倍，原紅細胞的細胞核體積約為紅細胞細胞核的4.5倍，基本都呈圓形(類圓形)。粒細胞系中，同一時期的中性粒細胞均比同時期的嗜酸性粒細胞的細胞體、細胞核大。成熟的嗜酸性粒細胞體積相對于粒細胞系整體細胞體積明顯偏小，與成熟的中性粒細胞相比，體積相差較大；成熟的中性粒細胞的體積均比中性晚幼粒細胞、中性中幼粒細胞、早幼粒細胞大，原單核細胞是所有原血細胞中體積最大的。原淋巴細胞是所有原血細胞中體積最小的。大淋巴細胞與小淋巴細胞的體積差別較大，大淋巴細胞的細胞體積約是小淋巴細胞的3倍，細胞核體積約是小淋巴細胞的1.5倍。巨噬細胞是珍珠龍膽石斑魚的血細胞中體積最大的細胞；血栓細胞是體積最小的細胞(表1)。

表1 珍珠龍膽石斑魚血細胞的計數與測量Tab.1 Count and measurement of blood cells in grouper hybrid E.lanceolatus ♂ × E.fuscoguttatus ♀

(續表1)

3 討 論

3.1 珍珠龍膽石斑魚血細胞的發育及特點

在紅細胞系的發育過程中，細胞體逐漸變小，細胞質顏色逐漸變淺，細胞核逐漸變小，細胞核染色質的顏色逐漸變深，最后致密成塊。與興國紅鯉(Cyprinuscarpio)[4]、點帶石斑魚(E.malabaricus)[6]、淡水石斑魚(Cichlasomamanaguense)[7]紅細胞的發育過程中細胞體由大變小,再變大不同。與長吻(Leiocassislongirostris)[8]細胞體積由大到小，由小到大再變小的“兩大兩小”發育過程不同。

粒細胞系發育過程中，其中性粒細胞細胞體的體積先由大變小，再變大，細胞核逐漸變小，嗜酸性粒細胞的細胞體積逐漸變小，細胞核逐漸變小。這與興國紅鯉[4]、斜帶石斑魚(E.coioides)[9]中性粒細胞先變大再變小不同。與淡水石斑魚[7]、長吻[8]、長鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)[10]中性粒細胞、嗜酸性粒細胞的體積逐漸變小略有不同。與點帶石斑魚[6]的中性粒細胞先由大變小，再由小變大，再變小不同。

單核細胞系發育中，細胞逐漸變小，細胞核也逐漸變小。這與點帶石斑魚[6]的先變小再變大不同。與淡水石斑魚[7]的單核細胞在發育的過程中細胞體逐漸變小相同。與斜帶石斑魚[9]的先由大變小，再由小變大不同。

淋巴細胞系發育中，細胞逐漸變小(大淋巴細胞除外)，細胞核也逐漸變小(大淋巴細胞除外)。這與點帶石斑魚[6]、斜帶石斑魚[9]的淋巴細胞的逐漸變小的過程相同。與淡水石斑魚[7]的先變大再變小不同。

各個時期的核仁均從有至無，與其他魚類相同。

魚類血細胞組成的特點與其發育情況、分類地位及生活習性之間的相互聯系還有待進一步研究。

珍珠龍膽石斑魚的血細胞的發育與部分的魚類血細胞的發育不同，特別是紅細胞和粒細胞的發育，可能是因為細胞分類時沒有對幼紅細胞進行進一步細分，忽略了晚期的幼紅細胞有絲分裂細胞體積變大的過程；也可能是由不同魚種間差異導致。

3.2 石斑魚血細胞的體積大小

對比其他魚類，無論是石斑魚還是其他非石斑魚，如點帶石斑魚[6]、淡水石斑魚[7]、長吻[8]、斜帶石斑魚[9]、長鰭裸頰鯛[10]、花尾胡椒鯛(Plectorhinchuscinctus)[11]、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[12]等，珍珠龍膽石斑魚血細胞的體積明顯比其他魚類的血細胞的體積大，基本是其他魚類的2倍。因為珍珠龍膽石斑魚是新種的雜交魚，具有雜交優勢[13-14]，細胞體積比較大。

觀察發現，珍珠龍膽石斑魚的中性成熟粒細胞的細胞體積遠比嗜酸性成熟粒細胞的大，其他研究中暫未發現類似的情況。這種情況為首次發現，可能是變異或其他原因導致，但未深入研究。兩種粒細胞的發育過程中體積變化也不相同，可能與兩種粒細胞的功能有關。

在體腎中還發現了巨大的巨噬細胞和網狀細胞，但未發現其發育過程。有部分學者[12]認為巨噬細胞來源于單核細胞，但在不同的魚類中，巨噬細胞被觀察到所處器官不一致，且暫未有直接證據顯示巨噬細胞由單核細胞發育而來，因此需進一步研究。

3.3 血細胞發生的場所

頭腎和體腎是珍珠龍膽石斑魚紅細胞、粒細胞的主要發生器官。頭腎、體腎、脾臟是原單核細胞、原淋巴細胞發生的主要場所。因此，珍珠龍膽石斑魚最主要造血器官是頭腎。上述結論與點帶石斑魚[6]、斜帶石斑魚[9]紅細胞的主要發生器官可能是頭腎，其他各類血細胞發生的主要場所為頭腎和體腎的結論一致；與淡水石斑魚[7]、長鰭裸頰鯛[10]的情況相似；與長吻[8]主要的造血器官是頭腎、體腎和脾臟，紅細胞、粒細胞和淋巴細胞主要在腎臟和頭腎中發生的結論相似；與花尾胡椒鯛[11]的主要造血器官是頭腎，脾臟次之，體腎又次之的結論不同；與大彈涂魚[12]的紅細胞系和單核細胞系的發育主要在體腎，腎臟和脾臟中均存在淋巴細胞系和粒細胞系的發育的結論不一致。可以通過各個器官組織不同類型血細胞的原始型和未成熟型的數量和占血細胞總數的比例來分析血細胞發生的場所[15]。在頭腎涂片中，可以觀察到大量各類細胞的原始細胞和幼稚細胞，因此，頭腎是珍珠龍膽石斑魚的主要發生器官。

可以推測，珍珠龍膽石斑魚血細胞發生的情況、主要造血器官與其他石斑魚血細胞發生的情況相似，與其他非石斑魚的魚類略有不同，大體上符合硬骨魚的血細胞發生、發育特點。