干露脅迫對脊尾白蝦存活率及氧化應激反應的影響

鄧高威，段健誠，王 玉，王林華，歐陽樂飛，高 煥,2,3，賴曉芳,2,3，張慶起，閻斌倫,2,3

(1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014；4.連云港贛榆佳信水產開發有限公司，江蘇 連云港 222100)

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)分布于印度—西太平洋區、韓國和我國近海，是我國特有的廣鹽性經濟蝦類，其產量在我國東部沿海地區的混合養殖模式中占1/3。脊尾白蝦繁殖能力強、生長速度快、環境適應性廣[1]，養殖規模逐年增加[2]。

干露是指水生動物短時間或長時間離開水體的一種狀態，是自然環境、養殖或運輸等過程中常見的一種現象[3]。干露狀態的甲殼動物主要遭受失水和低氧脅迫，產生過量活性氧、乳酸及有毒脂質過氧化物等，影響正常生理代謝，導致機體損傷或死亡。在機體受到干露脅迫時，抗氧化酶發揮重要作用。干露脅迫對貝類的影響已有大量研究，但對甲殼類動物的影響研究僅有少量報道。段亞飛等[4]研究表明，干露脅迫可顯著影響日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)抗氧化酶活性。姜娜等[5]研究發現，隨著干露時間的增加，三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)肝胰腺總抗氧化能力顯著降低。然而，目前關于干露脅迫對脊尾白蝦存活率和抗氧化系統的影響尚未見報道。筆者通過測定不同干露條件對脊尾白蝦存活率和抗氧化酶活性的影響，旨在探討不同干露條件下其耐干露能力和機制，為生產實踐提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用蝦

脊尾白蝦為本試驗室自繁自育，選擇健康活力強的個體用于試驗，體長(4.1±0.1) cm，體質量(1.92±0.12) g，在1000 L的聚氯乙烯桶中暫養，90尾/桶。暫養海水鹽度22，pH 8.0，溫度25 ℃，持續充氧，每日早晚各投喂1次，每2 d換水1/3，暫養7 d。

1.2 干露脅迫試驗

試驗設置5組：1個對照組(繼續暫養)和4個試驗組(常溫干燥組、常溫濕潤組、低溫干燥組和低溫濕潤組)。每組30尾，3個平行。常溫干燥組和常溫濕潤組：在封閉無風的室內進行，空調調制室溫25 ℃，濕度62%～65%，脊尾白蝦放于干凈泡沫板上進行干露，常溫濕潤組每0.5 h噴灑一次海水，使其周圍濕度為70%～75%。低溫干燥組和低溫濕潤組：在冰箱保鮮層進行，設置溫度6 ℃，低溫濕潤組每0.5 h噴灑一次海水，使其冰箱保鮮層濕度為70%～75%。

記錄每組脊尾白蝦各時間點的存活情況，并計算累計存活率。每組在試驗開始的0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h各隨機挑選3尾脊尾白蝦，取肌肉組織凍存于-20 ℃冰箱，用于測定抗氧化酶活性。

1.3 樣品制備

取0.2 g肌肉組織，放入4 mL離心管，加入1.8 mL預冷的0.86%生理鹽水，制成10%組織勻漿。勻漿于低溫離心機4 ℃、2000 r/min離心10 min，取上清液測定組織抗氧化酶活性。

1.4 酶活性的測定

組織蛋白和丙二醛含量及過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。組織蛋白質量濃度采用考馬斯亮藍法。過氧化氫酶活性采用可見光法，其單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量為1個酶活性單位(U)。谷胱甘肽過氧化物酶活性單位定義：每毫克蛋白質，每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中谷胱甘肽過氧化物酶濃度降低1 μmol/L為1個酶活性單位(U)。超氧化物歧化酶活性采用羥胺法，其活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應液中超氧化物歧化酶抑制率達50%時所對應的超氧化物歧化酶量為1個超氧化物歧化酶活性單位(U)。丙二醛質量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法，其單位定義是每毫克組織蛋白中丙二醛物質的量(nmol/mg)。

1.5 數據分析

試驗數據以平均值±標準差表示，用統計分析軟件SPSS 25.0 進行單因素方差分析和LSD多重比較，差異顯著水平設為0.05。用Origin 2018繪制柱狀圖并標注差異顯著標志。

2 結 果

2.1 干露脅迫對脊尾白蝦存活率的影響

脊尾白蝦累計存活率見表1。干露開始后脊尾白蝦劇烈跳動，隨著時間推移，可見其鰓絲伴隨著頭胸甲內的殘余水分進行擺動，脊尾白蝦觸須和腿變綠，開始死亡。4個試驗組脊尾白蝦死亡速率由慢到快為：低溫濕潤組<低溫干燥組<常溫濕潤組<常溫干燥組。常溫干燥組的脊尾白蝦死亡速率最快，在3.0 h全部死亡，此時低溫濕潤組仍有40%個體存活；常溫濕潤組在試驗開始后5.0 h全部死亡；低溫濕潤組存活時間最長，在12.0 h時仍有4.4%的個體存活；對照組脊尾白蝦活力正常，未出現死亡。

表1 干露脅迫下脊尾白蝦的累積存活率 %Tab.1 Cumulative survival rate of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure

2.2 干露脅迫對過氧化氫酶活性的影響

干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織過氧化氫酶活性的影響見圖1。與對照組相比，干露脅迫后，試驗組脊尾白蝦肌肉中過氧化氫酶活性顯著上升(P<0.05)，常溫干燥組在1.0 h達到最大值(8.63 U/mg)，是對照組的4.9倍(P<0.05)。常溫濕潤組在1.5 h達到最大值(8.26 U/mg)，是對照組的4.77倍(P<0.05)。低溫干燥組于2.0 h達到最大值(6.70 U/mg)，是對照組的3.87倍(P<0.05)。低溫濕潤組于2.5 h達到最大值(10.27 U/mg)，是對照組的5.94倍(P<0.05)。單因素方差分析表明，試驗組與對照組以及各試驗組間過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)。單因素方差分析表明，試驗組與對照組以及各試驗組間過氧化氫酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖1 干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織過氧化氫酶活性的影響Fig.1 Catalase activities in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.3 干露脅迫對谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織中谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響見圖2。與對照組相比，在干露脅迫條件下，常溫干燥組酶活性在2.5 h達到最大值(25.52 U/mg)，為對照組的1.35倍(P<0.05)。常溫濕潤組酶活性在0.5 h達到最大值(26.81 U/mg)，為對照組1.41倍(P<0.05)。低溫干燥組酶活性在1.0 h達到最大值(21.77 U/mg)，為對照組1.49倍(P<0.05)。低溫濕潤組酶活性在2.5 h達到最大值(32.44 U/mg)，為對照組的1.71倍(P<0.05)。單因素方差分析結果表明，試驗組與對照組以及各試驗組間谷胱甘肽過氧化物酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖2 干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig.2 Glutathione peroxidase (GPx) activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.4 干露脅迫對超氧化物歧化酶活性的影響

干露脅迫對脊尾白蝦肌肉中超氧化物歧化酶活性的影響見圖3。與對照組相比，常溫干燥組酶活性在2.5 h達到最大值(14.72 U/mg)，為對照組的1.59倍(P<0.05)。常溫濕潤組和低溫濕潤組酶活性均在2.0 h達到最大值(14.46 U/mg和12.72 U/mg)，分別為對照組的1.56倍和1.37倍(P<0.05)。低溫干燥組酶活性在1.0 h達到最大值(10.11 U/mg)，為對照組的1.09倍(P<0.05)。單因素方差分析結果表明，試驗組與對照組以及各試驗組間超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)。

圖3 干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Superoxide dismutase activity in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

2.5 干露脅迫對丙二醛含量的影響

干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織中丙二醛含量的影響見圖4。與對照組相比，常溫干燥組在1.5 h達到最大值(2.26 nmol/mg)，為對照組1.75倍(P<0.05)。常溫濕潤組和低溫濕潤組均在2.0 h 達到最大值(3.27 nmol/mg和2.92 nmol/mg)，為對照組2.53倍和2.26倍(P<0.05)。低溫干燥組在1.0 h達到最大值(2.03 nmol/mg)，為對照組的1.57倍(P<0.05)。單因素方差分析結果表明，試驗組與對照組以及各試驗組間丙二醛含量差異顯著(P<0.05)。

圖4 干露脅迫對脊尾白蝦肌肉組織丙二醛含量的影響Fig.4 Malonaldehyde content content in muscular tissue of ridgetail white prawn E.carinicauda exposed to air exposure stress

3 討 論

3.1 干露脅迫對脊尾白蝦存活率的影響

干露條件下水生動物的成活率受多種因素的影響，如溫度、濕度、發育階段[6-7]、形態差異[3]、物種[8]和干露時間等。研究發現，毛蚶(Scapharcasubcrenata)[9]耐干露能力受溫度影響較明顯，蝦夷扇貝 (Patinopectenyessoensis)[6]和單環刺螠(Urechisunicinctus)[10]的耐干露能力隨溫度升高而降低；施氏獺蛤稚貝(Lutrariasieboldii)[11]和三疣梭子蟹幼體[12]在20 ℃耐干露能力較強；低溫下厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)的耐干露能力是高溫時的3倍[13]。本試驗中，低溫干露組脊尾白蝦的存活率高于常溫干露組。可能是由于常溫環境脊尾白蝦鰓絲表面的水分蒸發快，鰓絲間水分會以更快的速度被蒸發，導致脊尾白蝦因不能正常攝取氧氣而加速死亡[14]。適當的降溫能降低水生動物新陳代謝、耗氧率和體力消耗，對氧氣、餌料和水分的需求減少，因此提高了耐干露能力[15]。

濕度也是影響干露存活率的另一個重要因素。處于干露狀態下的口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)[16]、天津厚蟹(Helicetientsinesis)[17]、厚殼貽貝[13]和日本囊對蝦[14]存活率與環境相對濕度呈正相關。本試驗的結果類似，常溫濕潤組脊尾白蝦存活時間高于常溫干燥組，低溫濕潤組脊尾白蝦存活時間高于低溫干燥組。可能是因為甲殼動物主要通過鰓絲表面的水分來進行呼吸，空氣中的氧氣進入鰓絲表面的水分里，再以溶解氧的形式被利用，濕潤環境增加鰓絲間的水分，提高鰓絲對空氣中氧氣的攝取能力，從而有效降低組織損傷，提高抗氧化能力。因此增加濕度可以減緩缺氧情況，提高耐干露能力和成活率[16]。

3.2 干露脅迫對脊尾白蝦抗氧化系統的影響

在應激脅迫環境中，動物機體因代謝異常產生過量的活性氧自由基，主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等，過量的活性氧可導致機體氧化損傷[18]。蝦類在長期的進化過程中形成一套抗氧化酶系統，主要有過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等，用來清除多余的活性氧，減少和避免氧化損傷對機體造成的損害[5]。因此，筆者選擇了過氧化氫酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量與抗氧化系統相關的指標，來反映脊尾白蝦在干露脅迫下機體生理生化變化情況。

過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶之間具有協同作用。生理條件下組織中存在一定活性氧自由基，超氧化物歧化酶中的Cu2+可被過氧化氫還原從而失去活性，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶可清除過氧化氫，一定程度上保護了超氧化物歧化酶。超氧陰離子自由基又能使過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶失活，而超氧化物歧化酶可將生物體內的超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧氣，保護這2種酶，3種酶形成互相保護的防御系統[19-20]。丙二醛既是機體內脂質過氧化反應的重要產物[21]，同時又可與蛋白質的游離氨基相互作用，引起蛋白質分子內與分子間交聯，導致細胞損傷[22-23]。超氧化物歧化酶可緩解與調節細胞氧化應激，清除自由基，促使機體恢復。

本試驗結果顯示，干露脅迫條件下，過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著上升(圖1)，超氧化物歧化酶活性則呈先降后升趨勢(圖3)，而丙二醛含量總體呈先升后降的趨勢(圖4)。分析可能是脅迫時產生的大量超氧陰離子自由基被超氧化物歧化酶還原成過氧化氫，超氧陰離子自由基的減少以及過氧化氫的大量產生，導致超氧化物歧化酶活性的下降[24]。超氧化物歧化酶活性隨著時間的推移呈上升趨勢，可能是在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶作用下，過氧化氫被分解成水和氧氣，抑制解除。過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著升高，說明干露脅迫導致脊尾白蝦缺氧，使體內活性氧自由基顯著增加，進而導致酶活性的升高[4]，機體需要提高抗氧化酶活性來適應這種脅迫環境[25]。de Almeida等[26]研究發現，干露脅迫后棕色貽貝(Pernaperna)肝胰腺中脂質過氧化物含量顯著增加。本試驗中，丙二醛含量呈先升后降的趨勢，表明干露初期過量活性氧超出脊尾白蝦抗氧化防御能力，對機體造成氧化損傷甚至致其死亡[27]；隨著活性氧積累，激化了抗氧化系統，增強了清除自由基的能力，使丙二醛含量下降。超氧化物歧化酶活性間接反映了機體清除氧自由基的能力，而丙二醛的含量間接反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度，兩者相互配合使用，有利于更好地了解脊尾白蝦的健康狀況[28]。

4 結 論

綜上所述，干露脅迫可誘導脊尾白蝦產生氧化應激反應，使過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性發生顯著變化，以消除丙二醛等有害物質。適量的降低溫度、提高濕度可降低干露脅迫所帶來的機體損傷，顯著提高脊尾白蝦干露脅迫下的存活率。