水產(chǎn)品中內(nèi)分泌干擾物殘留檢測方法研究進展

黃合田，楊鴻波，孫曉紅，郭 峰

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014；3.國家地質(zhì)實驗測試中心，自然資源部生態(tài)地球化學(xué)重點實驗室，北京 100037)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs),是一類存在于環(huán)境介質(zhì)中并介導(dǎo)生物體內(nèi)分泌激素的合成、釋放、代謝、結(jié)合和排泄作用，對其后代產(chǎn)生有害影響的外源性化學(xué)物質(zhì)；因干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的過程與雌激素類似，故也被稱為環(huán)境激素[1-2]。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物分為自然存在和人為合成，人為合成的主要來源于人類廣泛的農(nóng)業(yè)和工業(yè)活動，如常見的有機氯農(nóng)藥、己烯雌酚、雙酚A、多環(huán)芳烴類和多氯聯(lián)苯類(PCBs)等，研究表明，其中已有300多種物質(zhì)危害人類和動物的健康[3-5]。近年來隨著環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的廣泛應(yīng)用以及未經(jīng)處理的各類廢水排放，使得各地環(huán)境受到不同程度的污染。Luo等[6]檢測分析了湘江的21種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)量濃度水平，發(fā)現(xiàn)烷基酚的質(zhì)量濃度最高，為0.8～3100 ng/L；Kumirska等[7]利用氣相色譜質(zhì)譜法分析污水處理廠的污泥和魚塘沉積物，檢出17-β-雌二醇、17-α-炔雌醇等13種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，質(zhì)量濃度為未檢出～489 μg/kg。

隨著養(yǎng)殖業(yè)和近海漁業(yè)的快速發(fā)展，集中飼養(yǎng)已成為主要的飼養(yǎng)方式。為提高產(chǎn)量在飼料中添加蛋白同化類激素藥物增加水產(chǎn)品蛋白轉(zhuǎn)化率，或是直接在養(yǎng)殖水中施用過量的藥物用于治療和預(yù)防疾病。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定、不易降解、半衰期長，極易在環(huán)境中積累并破壞生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[8-9]。研究表明，環(huán)境中類固醇類激素質(zhì)量濃度1 ng/L時即可影響水生生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的正常功能[10-11]。如不利于雌魚卵母細胞生長和成熟；雄魚的睪丸變小且精子數(shù)量減少；促性腺激素釋放激素、神經(jīng)元的破壞和免疫系統(tǒng)功能異常[12-14]。有研究表明，一定劑量的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物會影響人體健康，如發(fā)生骨細胞的分化和凋亡，誘發(fā)女性過早絕經(jīng)并影響生殖發(fā)育，增加患乳腺癌等疾病的風(fēng)險，導(dǎo)致DNA編碼、蛋白質(zhì)合成和體內(nèi)內(nèi)源性激素代謝異常從而進一步影響各個系統(tǒng)的正常功能等[11,15-16]。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署出版的《關(guān)于EDC的第二份科學(xué)聲明》表示，肥胖等慢性非傳染性疾病、生殖系統(tǒng)疾病和激素敏感性癌癥等的發(fā)生與環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露密切相關(guān)[1]。目前，國內(nèi)外均有相關(guān)的法律和法規(guī)限制或禁止將己烯雌酚等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。我國農(nóng)業(yè)部235號公告修改版《動物性食品中獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了丙酸睪酮等藥物可作為治療藥物，但不得在動物性食品中檢出，醋酸甲孕酮、己烯雌酚、甲基睪丸酮等禁止使用，同時在食品中也不得檢出。

為保障我國水產(chǎn)品食品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，必須加強水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的檢測和監(jiān)督管理。由于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物種類繁多、化學(xué)性質(zhì)差異大、含量低，并且水產(chǎn)品含有大量的脂肪基質(zhì)等干擾物質(zhì)，需要相適應(yīng)的前處理技術(shù)進行分離凈化以及高通量、高靈敏度的檢測分析技術(shù)。筆者綜合近年來已發(fā)表的文獻，闡述水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的提取、凈化和儀器檢測方法，包括傳統(tǒng)和新型提取技術(shù)的比較和應(yīng)用，固相萃取等常用的凈化技術(shù)，以及高靈敏度的質(zhì)譜方法和快速分析的免疫分析法，為今后快速、簡便、高效地檢測水產(chǎn)品中的多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留檢測技術(shù)

1.1 樣品前處理技術(shù)

樣品的提取是影響檢測分析方法結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因素，如果樣品凈化不完全易導(dǎo)致嚴重的基質(zhì)效應(yīng)和儀器污染。水產(chǎn)品中含有豐富的脂肪酸和油脂，極易影響水產(chǎn)品中殘留環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的提取和凈化。

1.1.1 樣品提取技術(shù)

水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的提取效率是前處理的關(guān)鍵，直接影響方法的靈敏度。現(xiàn)已報道的傳統(tǒng)提取方法如索氏提取、液液萃取、超聲波萃取等方法，以甲醇、乙腈和正己烷等溶劑為提取液。但這些處理方法存在操作繁瑣、有機溶劑消耗大、重復(fù)性差以及回收率低等缺點。隨著新技術(shù)的發(fā)展，如雙水相萃取、亞臨界萃取、固相微萃取、QuEChERs等方法有效克服傳統(tǒng)提取方法的缺點，具有操作簡單、省時、溶劑消耗量少、回收率高且重復(fù)性好等優(yōu)點，在食品和環(huán)境等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Wang等[17]使用索氏提取、加速溶劑提取和微波輔助萃取提取魚樣中多氯聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚，萃取的時間由24 h縮至40 min；對于辛醇—水分配系數(shù)大的多氯聯(lián)苯同源物，索氏提取的回收率低于加速溶劑提取和微波輔助提取法。水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的提取方法的應(yīng)用及主要特點見表1。

表1 水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留分析提取技術(shù)的應(yīng)用及特點Tab.1 Application and characteristics of extraction and analysis methods of endocrine disrupting chemicals(EDSs) in fishery products

由表1可知，各種前處理提取方法均有各自的優(yōu)缺點，可將多種提取方法結(jié)合使用，提高提取效率。對實際樣品的檢測分析，需要根據(jù)水產(chǎn)品的種類、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的特性以及所使用儀器的靈敏度等選擇相應(yīng)的提取方法，保證獲得檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。

1.1.2 樣品凈化方法

目前常用的凈化方法為柱層析法、固相萃取(SPE)法和凝膠滲透色譜法。凝膠滲透色譜法是以多孔性凝膠為固定相，根據(jù)相對分子量的大小對樣品中各組分進行分離的方法。分子量小的物質(zhì)進入凝膠孔中停留時間長，分子量越大停留時間越短。凝膠滲透色譜法去除脂肪、蛋白質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)效率高，通過優(yōu)化雜質(zhì)洗脫時間和主收集時間可得到較好的凈化效果，有利于目標(biāo)分析物的富集得到較好的回收率[24]。柱層析法和固相萃取原理類似，均是通過吸附和洗脫的方法對樣品進行分離和純化[25]。柱層析法根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附能力，收集不同填料層的洗脫液。相對于此，固相萃取法通過少量的洗脫液完成水產(chǎn)品中單個或多種殘留環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的凈化和富集，有利于環(huán)境的綠色建設(shè)，并且現(xiàn)在使用的固相萃取柱多為商業(yè)化產(chǎn)品，種類繁多并且材料填充緊實，凈化材料也不易吸附待測組分，尤其對于短時批量凈化和富集水產(chǎn)品中殘留環(huán)境內(nèi)分泌干擾物十分方便，是目前最常用的凈化手段。3種凈化方法的部分應(yīng)用實例見表2。

表2 水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留分析凈化技術(shù)的應(yīng)用Tab.2 Application of purification technology in residue analysis of EDCs in fishely products

2 檢測技術(shù)

2.1 色譜法

色譜法是根據(jù)物質(zhì)在不同固定相中的選擇性分配，不同的物質(zhì)在流動相洗脫下以不同的速度移動，最終實現(xiàn)分離的效果。如高效液相色譜技術(shù)以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，因其分離效率高、分析速度快被廣泛應(yīng)用。適用于分析不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的物質(zhì)。同時高效液相色譜可結(jié)合紫外檢測器、熒光檢測器等不同的檢測器使用。江潔等[18]采用液液萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)檢測分析羅非魚肌肉組織中的6種激素，其中雌二醇、睪酮、甲基睪酮、醋酸甲輕孕酮的回收率較好(>70%)，檢出限為0.05～0.10 ng/L。Ismail等[19]采用高相液相色譜結(jié)合熒光檢測技術(shù)檢測魚類中的雙酚A，檢出限為0.005 μg/kg，在250 μg/kg、500 μg/kg加標(biāo)水平下回收率為61.54%～93%。但是此技術(shù)消耗有機溶劑量大，要求復(fù)雜基質(zhì)的樣品前處理凈化程度高；相對于質(zhì)譜等高靈敏度的分析器，含量較低的樣品易導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2.2 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是現(xiàn)在分析手段中最常用的檢測技術(shù)，通過氣相或液相與質(zhì)譜聯(lián)用，并結(jié)合高效凈化的前處理技術(shù)能在短時間內(nèi)同時分析檢測復(fù)雜基質(zhì)中的多種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，利用四級桿質(zhì)譜、飛行時間質(zhì)譜、四級桿—靜電場軌道阱質(zhì)譜等質(zhì)量分析器，獲得分子離子峰的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和碎片離子等信息，準(zhǔn)確定性定量分析不同基質(zhì)中的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。因其高通量、高靈敏度和高精密度成為分析檢測各種介質(zhì)中痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的常用手段。

氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是現(xiàn)在常用于分析易揮發(fā)、熱穩(wěn)定類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的主要分析手段。通過氣相色譜分離組分復(fù)雜的痕量有機物，并結(jié)合質(zhì)譜的高靈敏度對化合物實現(xiàn)分離和準(zhǔn)確定量分析。Liu等[31]利用氣相色譜質(zhì)譜法和選擇離子監(jiān)測模式分析檢測云南昆明水產(chǎn)品市場魚中的8種類固醇激素和酚類物質(zhì)，各物質(zhì)回收率為55.1%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～12.7%，方法檢出限為0.3～0.7 μg/kg。但對于低揮發(fā)性、含量極低的部分類固醇類激素則需要衍生化來滿足儀器檢測靈敏度。而衍生化會使得前處理操作繁瑣和耗時，并且衍生化的反應(yīng)時間、溫度、衍生化試劑的極性大小和用量對衍生化效率都有較為明顯的影響，同時還會產(chǎn)生副產(chǎn)物[32-34]；并且同時衍生化多種類別激素比較困難。近年來文獻采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀為檢測手段的研究見表3。

表3 水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測實例Tab.3 Examples of EDCs residue detection in fishery products by GC-MS or GC-MS/MS

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法與氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法類似，是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。相對于氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理操作相對簡單，不需要對目標(biāo)分析物進行衍生化，可以分析某些難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物。Ye等[42]建立了超高效色譜質(zhì)譜聯(lián)用法快速篩查和定量分析魚肉中甾體激素和酚類物質(zhì)，平均回收率為71.2%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于16%，檢出限0.04～0.08 ng/g。近年來飛行時間質(zhì)譜、四級桿—靜電場軌道阱質(zhì)譜等在食品安全領(lǐng)域逐漸深入使用，利用高分辨質(zhì)譜的高分辨率、高靈敏度和強抗干擾能力，以及結(jié)合相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫可高通量快速篩查水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留，同時還可通過數(shù)據(jù)回顧性分析發(fā)現(xiàn)其他潛在的有機污染物。如鞠玲燕等[43]采用超高效液相色譜結(jié)合四極桿—靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和分析水產(chǎn)品中28種農(nóng)藥類環(huán)境激素，回收率為65.6%～98.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.2%～11.3%，檢出限<10 μg/kg。應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法進行水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的檢測見表4。

表4 水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測實例Tab.4 Examples of EDCs residue detection in fishery products with LC-MS/MS

(續(xù)表4)

2.3 免疫分析法

免疫分析法是利用抗體和抗原特異性的結(jié)合對殘留的污染物進行檢測分析的方法，不需要昂貴的儀器設(shè)備，并且對操作人員的技術(shù)要求不高，具有便捷、快速、特異性強和靈敏等特點。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的檢測方法常用放射免疫測定法和酶聯(lián)免疫吸附法。魚中卵黃蛋白原是雌二醇在雌二醇循環(huán)過程中產(chǎn)生的，其含量代表生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)狀態(tài)的綜合指標(biāo)，同時被用作監(jiān)測環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的重要生物標(biāo)志物[53]。Lim等[54]開發(fā)了酶聯(lián)免疫吸附法檢測雌激素的結(jié)合受體卵黃蛋白原用以檢測魚血清中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的含量，主要是通過卵黃蛋白單克隆抗體和多克隆抗體來檢測卵黃蛋白原，回收率達95%。Beitel等[55]采用酶聯(lián)免疫吸附法定量北美本地魚類血漿中11-酮睪酮和17-雌二醇，用以評估環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對魚類中類固醇激素生成的影響。徐美奕等[56]采用放射免疫法測定湛江海域養(yǎng)殖的5種常見魚肌肉中的5種激素的殘留量，并與野生魚類比較，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖魚中均有檢出且含量均高于野生魚。Metcalfe等[57]采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測3種不同種類的魚類血液中內(nèi)固醇激素，其回收率為90%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，此方法可用于魚類中激素的快速篩查。但由于通過抗原和抗體的特異性結(jié)合的方式實現(xiàn)分析檢測，不適用于同時檢測分析多種目標(biāo)物。水產(chǎn)品中由于富含脂肪，極易影響抗原和抗體的特異性反應(yīng)，故低含量樣品的精準(zhǔn)定量還需要借助靈敏度高的大型儀器檢測。

3 展望與未來

由于漁藥的不科學(xué)不合理使用、工業(yè)生產(chǎn)原料的大量使用以及生活和農(nóng)業(yè)污水的排放，使得養(yǎng)殖水環(huán)境中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物含量持續(xù)積累。近年來的研究顯示，極低含量的內(nèi)分泌干擾物已會嚴重影響生物體的健康，長期積累到一定量將導(dǎo)致機體不可逆的損害。水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留的檢測已成為監(jiān)測水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要手段。由于數(shù)量和種類的逐漸增多，有效準(zhǔn)確地檢測水產(chǎn)品中殘留的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物也愈加具有挑戰(zhàn)性。因此開發(fā)和建立簡便、快速、高效的前處理技術(shù)，以及高靈敏度和高通量快速篩查水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留的檢測分析方法是發(fā)展的必然趨勢。

前處理方法是環(huán)境激素檢測的重要基礎(chǔ)，經(jīng)過多年的發(fā)展，目前國內(nèi)外對水產(chǎn)品中殘留環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的前處理新的提取手段如乙腈—水雙水相萃取、亞臨界萃取、固相微萃取、QuEChERs等方法已逐漸取代索氏提取、液液萃取和超聲波萃取等耗時長、污染大的傳統(tǒng)提取方法，簡單、便捷、成本低、高通量的多組分同時提取凈化技術(shù)將是未來前處理技術(shù)發(fā)展的方向，以滿足社會日益增長的對環(huán)境監(jiān)測準(zhǔn)確、及時、方便的需求。

目前對水產(chǎn)品中殘留環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的檢測分析以色譜法、質(zhì)譜法為主要手段，因氣相色譜質(zhì)譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法具有較高靈敏度而得到了廣泛的應(yīng)用，但受限于儀器價格昂貴、操作復(fù)雜且不易攜帶，并未廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測。免疫分析法等生物檢測方法因其具有快速、靈敏、高效、適宜現(xiàn)場檢測等特點，將會在未來更多地應(yīng)用在環(huán)境激素現(xiàn)場檢測等方面。同時，為了應(yīng)對不斷增多的環(huán)境激素種類，開發(fā)研究新的檢測方法和技術(shù)也具有重要意義。

當(dāng)然，水產(chǎn)品的質(zhì)量安全僅靠養(yǎng)殖過程中和過后的監(jiān)測還遠遠不夠。探明水產(chǎn)品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的污染來源，從根源上查明此類物質(zhì)在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的使用也是重要的控制手段。應(yīng)倡導(dǎo)綠色生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，定期監(jiān)管飼養(yǎng)環(huán)境中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的水平，加強流通環(huán)節(jié)水產(chǎn)品的質(zhì)量檢測，從水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈的源頭上控制環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的污染，促進我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。