玉米赤霉烯酮時間分辨熒光試紙條的制備及特性研究

顧建華，嚴藝琳，楊婷婷?，祁蘇嫻，張海濤，王寶春

（1.蘇州市吳中區糧食質量監督管理站，江蘇 蘇州 215128；2.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063；3.淮安市城南糧庫，江蘇 淮安 223200）

玉米赤霉烯酮，又名F-2毒素（Zearalenone，簡稱 ZEN），是一種由鐮刀菌屬真菌分泌的類雌激素霉菌毒素，最初從發霉玉米中分離得到，普遍存在于玉米、小麥、大米、大麥、燕麥等農作物中，對動物的肝臟等器官造成較大損傷，在動物體內蓄積，引起動物機能異常甚至死亡，給農場造成巨大的影響和經濟損失[1-3]。目前，世界各地都對食品、谷物和飼料中的玉米赤霉烯酮的含量做了嚴格的規范，并制定了相應的玉米赤霉烯酮限量標準。例如歐盟除單獨規定玉米外，對小麥、稻谷等供人直接食用的谷物統一規定玉米赤霉烯酮含量不能超過100 μg/kg[4]，我國《GB 2761—2017食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》中明確規定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的殘留限量標準為 60 μg/kg[5]。因此，在現如今食品加工和畜牧業生產中，對這種有害人身體健康的真菌毒素的防控就顯得尤為重要。

目前，常用的檢測糧食中玉米赤霉烯酮的方法有：高效液相色譜法、薄層色譜法、免疫分析方法、液相色譜-質譜法[6-8]等。HPLC檢測法作為國標中的第一法，應用最為廣泛，雖然該方法靈敏度較高，檢測極限低，但此方法檢測過程較為復雜，儀器價格昂貴，對操作人員要求較高，操作時間長，不利于檢測技術的現場推廣應用。ELISA法雖然操作簡單、靈敏度高，但不適合現場檢測。時間分辨熒光免疫分析測定是一種新一代標記免疫測定技術，根據鑭系元素螯合物的長壽命的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，通過同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，具有靈敏度高、快速、靈活，試劑無放射性污染等特點[9-10]，在醫療、環境、食品等領域廣泛應用[11-14]。

“舌尖上的安全”需要以方便、快速、準確、易普及的檢測技術作為支撐，為更好的發揮快檢方法對食品安全監控的基礎支撐作用，在傳統的膠體金免疫層析半定量技術基礎上，對抗體標記物及標記技術進行革新，建立了玉米赤霉烯酮時間分辨免疫層析定量檢測法。該方法采用高靈敏度有機熒光納米微球作為示蹤物來標記抗體，提高了標記物的穩定性。微球包裹的銪元素在340 nm紫外光源的照射下發出高強度的熒光，且該熒光壽命長，利用延緩測量時間，待樣品基質中自然發生的短壽命熒光（1～10 ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣可以更多的排除特異本底熒光的干擾，解決了食品檢測過程中基質干擾問題，提升了檢測的準確度，適合大批樣品的測定，在市場上更容易受到青睞[15]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

玉米赤霉烯酮標準品（純度≥98%）、碳二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma-Aldrich公司；ZEN-BSA偶聯物、抗玉米赤霉烯酮單抗（純度≥95%，蛋白濃度18.49 mg/mL，亞型IgG2a，親和常數9.8×107L/mol，與ZEN、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇以及玉米赤霉酮的交叉反應率分別為100%、95%、38%、133%、69%和 118%）：江蘇省蘇微微生物研究有限公司制備；羊抗鼠IgG（10 mg/mL）：上海杰一生物有限公司；銪Eu3+納米微球（平均粒徑200 nm，表面活性基團-COOH，激發365 nm、發射 615 nm）：長沙美牛生物科技有限公司；硝酸纖維素膜CN95、CN140：德國賽多利斯；硝酸纖維素膜Pall90：美國Pall公司；樣品墊（SB08）、吸水紙（SX27）、PVC底板（SM31-25）：上海金標生物科技有限公司；玉米、小麥等糧食及其制品：市場購買。

SW-2時間分辨熒光檢測儀、ZEN親和柱：江蘇省蘇微微生物研究有限公司；GL-21M 高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；HS-3垂直混勻儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；JP-100T超聲機：深圳市潔盟清洗設備有限公司；BPG-9240A精密鼓風干燥箱：上海精科實業有限公司；HM3035三維劃膜噴金儀、CTS300數控裁條機、ZQ2000自動斬切機：上海金標生物科技有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司；色譜柱（HP-C18，4.6*150 mm，5 μm）：美國賽芬科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗ZEN單抗的熒光納米微球標記

將 200 nm時間分辨熒光微球超聲分散10 min，取100 μL超聲后的微球于2 mL圓底離心管中，加入 900 μL超純水混勻，并超聲分散5 min。分別配制 50 mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）與碳二亞胺（EDC）的乙醇溶液，各取50 μL加入微球懸液，混勻后于垂直混勻儀上活化40 min，15 000 r/min離心30 min，去上清，加入1 mL超純水，超聲5 min使微球分散。于活化后的微球懸液中加入抗ZEN抗體，置于垂直混勻儀上反應2 h，加入BSA使之最終濃度為0.5%，封閉1 h，15 000 r/min離心30 min，去上清，加入1 mL微球保存液超聲分散后冷藏備用。

1.2.2 層析膜的制備

將裁成25×300 mm的硝酸纖維素膜，置于三維劃膜噴金儀平臺上；用含 1.5%蔗糖和 1.5%海藻糖的 PBS（0.01 mol/L/pH7.2）分別溶解ZEN-BSA包被抗原和羊抗鼠IgG至一定濃度，分別放于存儲池A和B；以1 μL/cm的劃膜量分別將上述溶液劃線于 NC膜中央，形成檢測線和質控線印跡，兩者相距4 mm，其中質控線距離試紙條頂端25 mm；于45 ℃鼓風干燥箱中干燥24 h以上，將層析膜置于鋁箔袋中，干燥保存備用。

1.2.3 熒光免疫試紙條的組裝

以PVC膠粘板作襯板，將層析膜粘貼在襯板的中央。將樣品墊、吸水紙分別粘貼在層析膜的兩端，并且兩墊之間有1～2 mm的交聯。將組裝好的試紙條大板用自動斬切機切割成寬4 mm、長60 mm的板條，裝于塑料卡殼中，用壓殼機壓緊。放入帶干燥劑的鋁箔袋中，連續封口機封口后，常溫保存。

1.2.4 反應條件的優化

1.2.4.1 熒光微球標記的抗體和包被抗原濃度的優化 將C線上二抗的濃度固定為0.5 mg/mL，通過改變T線上ZEN-BSA包被抗原和熒光微球標記單抗的濃度，以ZEN標準溶液來考察所制成的試紙條，選擇熒光背景弱、熒光峰值高，且 T線與C線的熒光強度之比在 1.0～2.0之間的作為包被抗原與標記抗體的最佳濃度。

1.2.4.2 原材料的選擇 選擇 Pall 90、Starorius CN140和Starorius CN95三種不同規格的硝酸纖維素膜，按照上述確定的優化條件，用ZEN系列標準品溶液（0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL）點樣，觀察熒光微球在NC膜上的移動速度、背景是否干凈等；反應結束后，采用時間分辨熒光免疫分析儀讀數，考察線性范圍和相關系數（R2）等，優選出合適的硝酸纖維素膜。

1.2.5 標準曲線的建立

在 1.2.4確定的最佳優化條件下，準確配制0.01 mol/L的 pH為 7.2的磷酸鹽緩沖液，加入0.4%的吐溫-20，將熒光微球標記的抗ZEN抗體以此分析緩沖液稀釋至合適倍數作為樣品稀釋液。將ZEN的標準品，用50%乙腈-水（體積比）定容配制成410.4 ng/mL的標準儲備溶液；再用5%甲醇-樣品稀釋液（體積比）稀釋成0.00、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 濃度標準工作溶液。分別取100 μL加至試紙條的樣品孔中，25 ℃下反應10 min，由低濃度到高濃度進行檢測，時間分辨熒光儀檢測T線熒光強度與C線熒光強度，計算T/C值。以標準工作溶液濃度的自然對數值（lnC）為橫坐標，各濃度標準液的T/C值與0 ng/mL標準液的T/C值的比值所得百分比為縱坐標，建立標準曲線。

1.2.6 樣品處理與測定

準確稱取5 g粉碎均勻樣本，量取25 mL 80%甲醇-水至 50 mL離心管中，混勻，密封；至漩渦混勻器上渦旋提取 2 min，于離心機中4 000 r/min離心5 min，得上清液。測試前將未開封的檢測卡及待檢樣本平衡至 25 ℃；將檢測卡平放，用移液器定量吸取50 μL清液加入750 μL樣本稀釋液中，至漩渦混勻器上混勻，后再吸出100 μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，開始計時；反應10 min后，將檢測卡放入時間分辨熒光免疫層析檢測儀中，儀器讀數完成后會自動計算出被檢樣本中的ZEN含量，可選擇儲存及打印結果。

1.2.7 方法學評價

1.2.7.1 檢出限與定量限 取 20組無污染的樣品，用玉米赤霉烯酮定量試紙條對其進行檢測，以空白樣品 20次測定結果的均值加 3倍的標準差，即為檢出限；以測定結果的均值加10倍的標準差，即為定量限[16-17]。

1.2.7.2 穩定性 本實驗測試試紙條在 1年的保存時間是否有效，根據阿倫尼烏斯公式，將試紙條是置于50 ℃老化23 d未變質，相當于室溫1年有效[18-19]。本實驗將試紙條置于50 ℃ 42 d加速反應后與未加速的試紙條作對比，考察其穩定性。

1.2.7.3 準確性與重復性 采用空白樣品加標回收實驗，在小麥、玉米陰性樣本中分別加入低、中、高濃度的ZEN標準品，根據SW-2時間分辨熒光檢測儀T/C值和標準曲線得出檢測濃度。加標回收率=（實測濃度-空白濃度）/加標濃度×100%。

1.2.7.4 與 HPLC法對比驗證 選取小麥、玉米等樣本共20份，按1.2.6方法處理，同一份樣品分別采用ZEN熒光試紙條和IAC-HPLC法進行測定。結果對比分析，進一步驗證該方法與國家標準方法的一致性。

1.2.7.5 特異性 配制 1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A這4種毒素的標準溶液，用本實驗建立的檢測方法進行檢測。

2 結果與討論

2.1 反應條件的優化

2.1.1 熒光微球標記單抗濃度及包被抗原劃膜質量濃度的確定

不同包被抗原與標記單抗濃度的匹配結果見表 1，標記單抗的量越多，對于不同濃度的ZEN抑制率越差，但單抗用量不可過少，選擇合適的熒光強度之比，確定劃膜濃度為 0.1 mg/mL，熒光微球標記的單抗終濃度為0.02 mg/mL。

表1 包被抗原與標記單抗濃度的確定Table 1 Determination of the concentration of antigens and labeled antibodies

2.1.2 原材料確定

三種硝酸纖維素膜對顯色和線性的檢測結果見表2。結果顯示，賽多利斯CN95膜的顯色速度較快，背景清晰干凈，且線性良好。從表3三種硝酸纖維素膜對熒光強度和 T/C的影響結果來看，在同樣的 T線包被濃度下，賽多利斯 CN95膜所測出的熒光強度較其他兩種膜要高。因此，從節約原材料成本方面等方面綜合考慮，最終選擇賽多利斯CN95膜作為本研究最佳的NC膜材料。

表2 三種規格硝酸纖維素膜對顯色和線性的影響Table 2 Effect of three types of nitrocellulose films on color development and linearity

表3 三種規格硝酸纖維素膜對熒光強度和T/C值的影響Table 3 Effects of three types of nitrocellulose films on fluorescence intensity and T/C value

2.2 標準曲線的建立

由圖1可以發現橫坐標采用的是濃度的自然對數，但是通過繪制得到的是平滑的S曲線，這與免疫競爭得到的曲線是一致的[20]；同時在0.1～5 ng/mL濃度范圍內，有效劑量值即抑制率（以下采用 B/B0表示）在 92%～19%，線性回歸相關系數 R2達 0.993 3，直線方程 y = -0.183 6x +0.475 7。由此，確定標準曲線的線性范圍，并以此作為以下實驗的線性濃度。

圖1 不同濃度（0.05～10 ng/mL）平滑曲線Fig.1 Smooth curve of different concentrations (0.05～10 ng/mL)

2.3 檢測限和定量限的確定

測定結果和計算結果見表 4。方法的檢出限為 10.05 μg/kg、定量限為 20.13 μg/kg。

表4 方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）（n=20）Table 4 The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of wheat flour

2.4 穩定性分析

檢測結果如圖 2所示，試紙條在 50 ℃存放28 d時，T/C值無明顯下降，在35 d之后，T/C值略有下降，說明試紙條在常溫下1年的穩定性良好。

圖2 試紙條穩定性分析Fig.2 Stability analysis of test strips

2.5 準確性和重復性分析

根據國家限量標準，設定3個濃度，涵蓋低、中、高濃度的加標回收測定。分別對陰性小麥及玉米進行不同水平的ZEN加標，加標濃度分別為20、60及120 μg/kg，用ZEN熒光試紙條重復測定5次，計算平均回收率在93.45%～112.2%之間，5次重復的變異系數在6.81%～12.31%之間（見表5）。

表5 小麥、玉米不同濃度加標回收率（n=5）Table 5 The recovery rate of different concentrations of wheat and corn (n=5)

2.6 與HPLC法對比驗證結果

將兩種方法對 20份典型樣品的檢測結果進行線性回歸分析，結果如圖 3，兩種方法的線性回歸系數 R2=0.959 2，結果高度相關，具有良好的一致性。

圖3 HPLC與試紙條測定樣品中ZEN的相關性Fig.3 Correlation between HPLC and test strips in the determination of ZEN in samples

2.7 試紙條的特異性

用ZEN熒光試紙條分別測定1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A這4種毒素的標準品，最后計算得出與玉米赤霉酮與黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A基本無交叉反應，說明該產品特異性良好。

3 結論

本研究方法基于抗原抗體的特異性免疫反應原理，采用高靈敏度有機熒光微球作為示蹤物這一新方法來標記抗體，從市場需求出發，創新性地研制出玉米赤霉烯酮時間分辨熒光免疫層析卡為核心產品的霉菌毒素快速檢測系統，具有小型、便攜、智能化等優點，形成了易于推廣和應用的霉菌毒素快速檢測系統用戶終端。

本實驗研制的玉米赤霉烯酮快速定量免疫試紙條，采用銪納米微球作為熒光探針，標記抗ZEN的單抗，通過競爭抑制建立免疫層析定量方法。試紙條的靈敏度為0.1 ng/mL，檢出限為10.05 μg/kg，定量限為20.13 μg/kg，顯著高于膠體金方法和酶聯免疫法的靈敏度，與一般的ELISA方法相比，試紙條的操作更加簡便，所需時間更短，可為實驗人員減輕負擔。其次，其他方法學參數評價結果表明，樣品的加標回收率在 93.45%～112.2%之間，對于同一個樣品的5次重復的變異系數均小于15%，采用IAC-HPLC法和試紙條同時檢測小麥、玉米等20份樣品，結果表明這兩種方法具有良好的相關性。其準確性和可靠性基本滿足了絕大多數糧食及其制品中玉米赤霉烯酮的檢測。

時間分辨熒光試紙條操作簡單，簡單樣本只需甲醇提取處理即可測定，從提樣至得出結果只需25 min；配套小型經濟、便于攜帶的熒光分析儀，不僅降低了企業的檢測成本，還有效提升了企業產品質量的檢測能力，同時也為政府職能部門提供了快速、有效、易于普及的檢測技術和手段，尤其適合基層單位，便于大量樣本的篩選。因此，具有非常好的推廣應用價值，有利于保障食品的質量安全和消費者的健康。