黑芝麻油卵磷脂溶液對自然生長老齡小鼠骨代謝的影響

呂思敏，黃志榮，于 瓊，孫金影，崔 燎，吳 鐵,?

（1.廣東醫科大學，廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯合研究中心，廣東 東莞 523808；2.廣東醫科大學 藥學院，廣東 東莞 523808；3.廣東醫科大學 廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023）

黑芝麻油是從黑芝麻中提煉出來的，黑芝麻油中富含不飽和脂肪酸——油酸和亞油酸，以及芝麻素、芝麻林素、芝麻酚、維生素E等抗氧化成分[1]。其中，維生素 E能維持細胞膜的完整性和正常功能，不僅具有顯著的抗氧化、增加免疫、延緩衰老、抗腫瘤及預防心血管疾病等功能，而且還具有優良的促進骨形成、抑制骨吸收功效[2]。黑芝麻油中的亞油酸、棕櫚酸等不飽和脂肪酸，容易被人體吸收，有助于消除動脈壁上的沉積物，且不飽和脂肪酸在骨質疏松治療和預防中的潛力逐漸顯現[3]。而我們課題組研究發現[4]，芝麻油在所用劑量下具有預防醋酸潑尼松致大鼠骨質疏松的作用，另外于瓊等[5]研究發現，3 mL/kg/d的黑芝麻油能良好的對抗環磷酰胺誘導的大鼠骨丟失模型中股骨微觀結構和骨質量的退化。為研究黑芝麻油卵磷脂溶液對自然生長老齡小鼠骨代謝的作用，本研究采用微計算機斷層掃描技術（Micro CT）和骨微量元素分析，以8月齡自然生長的小鼠作為空白對照，并以清除自由基的維生素E作為陽性對照，評價該黑芝麻油卵磷脂溶液的骨藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 材料

24只8月齡昆明種SPF級小白鼠，體質量為（47.84±4.92） g，雌雄各半：南方醫科大學實驗動物中心（動物質量合格證為：SCXK（粵）2011-0015）。

黑芝麻油（批號20140120）：平輿康博匯鑫油脂有限公司；卵磷脂（批號：714B024）：北京索萊寶科技有限公司；維生素E軟膠囊（批號：JE40007）：廣州星群（藥業）股份有限公司；生理鹽水（批號：14082501）：東莞市普濟藥業有限公司；羥脯氨酸測試盒：南京建成生物工程研究所。

實驗時用黑芝麻油配成 70 mg/mL的黑芝麻油-卵磷脂油溶液；實驗時用70 mg/mL黑芝麻油-卵磷脂油溶液配成維生素 E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液。

BT 25S電子天平：賽多利斯公司；電熱恒溫電烤箱：上海躍進醫療器械廠；電感偶合等離子體發射光譜儀（ICP）：美國TJA公司；Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機：德國 Eppendorf公司；Micro CT儀（viva CT40）：瑞士SCANCO Medical AG公司。

1.2 實驗方法

取上述小鼠按體重隨機分為3組，每組8只，（1）生理鹽水組（NS組）：給予生理鹽水灌胃；（2）黑芝麻油-卵磷脂油溶液（Oil組）：給予70 mg/mL的黑芝麻油-卵磷脂油溶液灌胃；（3）維生素E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液（VE組）：給予 25 mg/mL的維生素 E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液灌胃。上述動物分籠飼養，飼養條件相同，自由飲水和攝食。灌胃計量為10 mL/kg/d，實驗持續10周。每周稱體重1次，并按體重調整給藥的劑量。實驗結束時，小鼠進行頸椎脫臼處死，取右側股骨進行Micro CT掃描，取左側尺骨進行骨成分含量測定。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1 小鼠體重的觀察

小鼠按每周稱體重一次，于實驗結束前一天停止供應飼料，進行禁食12 h，稱重一次，作為小鼠最后的體重[6]。

1.3.2 Micro CT對小鼠股骨的分析

小鼠右側股骨除盡肌肉和附著組織后，放入Micro CT儀進行X射線掃描。Micro CT掃描條件如下：能量/強度為70 kVp，114 μA，8 W，整合時間為200 ms，圖像矩陣為2 048×2 048。以0°旋轉進行Micro CT掃描。掃描結束后，選取距離生長板遠端1.0 mm、層厚為2.0 mm的骨組織進行三維重建，以最低閾值為160提取三維圖像信息。使用儀器自帶軟件（SCANCO Medical AG）進行參數分析，參數選取骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨密度（Density）、骨小梁連接密度（Conn-Dens）、結構模型指數（SMI）及各向異性（DA）[7]。

1.3.3 小鼠羥脯氨酸、骨鎂和骨鈣含量的測定

精密稱重小鼠左側尺骨，后置于烤箱于80 ℃烘烤72 h后至恒重，再次精密稱重并記錄數據。之后將烘烤干的每一份骨組織標本放進10 mL安瓿瓶中，分別加入6 mol/L的鹽酸5 mL，然后酒精噴燈火燒密封安瓿瓶瓶口，再于108 ℃烤箱中消化24 h，之后取出過濾。量取0.25 mL尺骨原濾液，加入蒸餾水稀釋至5 mL，搖勻后為稀釋液。將骨稀釋液分成兩份，一份取 1 mL骨稀釋液，按照羥脯氨酸試劑盒的方法，測定吸光度，計算羥脯氨酸的含量，一份取骨稀釋液用ICP儀測定骨鎂、鈣的含量，再根據標準品含量和樣品稀釋倍數來計算鎂、鈣的含量[8]。

1.4 統計學分析方法

2 結果與分析

2.1 小鼠體重的變化

實驗開始時，各組間小鼠體重的差異均無統計學意義。實驗結束時，NS組小鼠體重比實驗前降低 9.63%，VE組小鼠體重比實驗前降低3.06%，Oil組小鼠體重比實驗前降低9.85%，說明實驗后，各組小鼠體重均比實驗前有所降低。結果見表1。

表1 小鼠體重的變化Table 1 Changes in body weight of mice

2.2 小鼠骨成分的變化

與NS組相比，VE組骨羥脯氨酸、骨鎂和骨鈣含量差別均無統計學意義，說明維生素E-黑芝麻油卵磷脂溶液不能改善自然生長老齡小鼠骨礦物質和有機質的丟失；Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，分別增加了 53.44%（P＜0.01）、58.04%（P＜0.01），說明黑芝麻油卵磷脂溶液可以抵抗骨礦物質的丟失。與VE組相比，Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，分別增加了29.83%（P＜0.01）、42.31%（P＜0.05），說明黑芝麻油卵磷脂溶液增加骨礦物質的作用較維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液強。結果見表2。

表2 小鼠尺骨干重，濕重，羥脯氨酸，鎂和鈣含量的變化Table 2 Variation of dry weight,wet weight,hydroxyproline,magnesium and calcium content of mouse ulna

2.3 小鼠Micro CT參數的變化

2.3.1 小鼠Micro CT掃描三維重建圖的變化

圖A為NS組，NS組骨小梁出現了斷裂變短，網狀結構退化，有較大的間隙出現在中央區域，這表明老齡小鼠給予生理鹽水 10周后，小鼠股骨的骨量減少，骨微觀結構受到破壞。B為VE組，骨小梁數目增加且變粗，間隙變小，連續性得到一定的恢復。C為Oil組，骨小梁分布排列緊密，均勻有序且間隙較小，連續性較好。以上結果表明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液和黑芝麻油卵磷脂溶液均不同程度的增加自然生長老齡小鼠股骨的骨量，微觀結構均有不同程度的改善。結果見圖1～3。

圖1 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（SEG圖）Fig.1 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (SEG image)

圖2 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（TH圖）Fig.2 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (TH image)

圖3 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（SP圖）Fig.3 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (SP image)

2.3.2 小鼠股骨Micro CT掃描參數的變化

與 NS組相比，VE組股骨 Micro CT參數BV/TV、Density和Conn-Dens均顯著增加，分別增加了 77.78%（P＜0.01）、71.24%（P＜0.01）、8.91%（P＜0.01），SMI顯著降低，降低了 36.54%（P＜0.01），說明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液可以增加正常生長老齡小鼠股骨的骨密度，骨小梁由桿狀結構轉變為板狀結構；Oil組Conn-Dens顯著增加 138.77%（P＜0.01），BV/TV、Density有所增加，分別增加了33.33%、31.27%，但差異無統計學意義，說明黑芝麻油卵磷脂溶液可以改善骨小梁的微觀結構，骨微觀結構得到一定的改善。結果見表3和表4。

表3 小鼠股骨Micro CT掃描參數的變化Table 3 Variation of Micro CT scan parameters of mouse femur

表4 小鼠股骨Micro CT掃描參數的變化Table 4 Variation of Micro CT scan parameters of mouse femur

3 結論

3.1 維生素E對自然生長8月齡小鼠骨代謝的作用

本實驗中，開始用藥前，各組間小鼠體重差異無統計學意義，實驗結束時，VE組小鼠體重比實驗前有所降低，說明隨著實驗時間增加，維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液可使自然生長老齡小鼠體重稍有降低。與NS組相比，VE組骨羥脯氨酸、骨鎂和鈣骨含量差別均無統計學意義，說明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液不能改善自然生長老齡小鼠骨礦物質和有機質的丟失。從 Micro CT三維圖可看出，VE組骨小梁數目增加且變粗，間隙變小，連續性得到一定的恢復。與 NS組相比，VE組股骨Micro CT指標的BV/TV和Density均顯著增加，SMI顯著降低，說明維生素E-黑芝麻油卵磷脂溶液可以增加正常生長老齡小鼠股骨的骨密度，骨小梁由桿狀結構轉變為板狀結構。

維生素E作為抗氧化劑，可增加谷胱甘肽過氧化物酶的活性，增強機體清除自由基的能力；可減輕運動中抗氧化酶所受的自由基損傷，減緩疲勞出現，從而提高運動的能力；還可以直接控制線粒體內過氧化氫的產生[9-10]。此外，維生素E的衍生物普遍參與質膜的組成，可增強肌纖維膜、線粒體膜和肌漿網膜的完整性和穩定性，防止肌漿網內Ca2+的大量溢出引發的骨骼肌損傷[11]。而氧化應激與骨之間具有明確的生物聯系，自由基可降解骨基質，降低骨形成活性；活化并促進破骨細胞的分化，激活骨吸收；抑制成骨細胞的分化，誘導單核細胞遷移并將單核細胞分化為破骨細胞，從而導致骨重建的解偶效應[2,12]。張益嘉等[3]研究發現，維生素 E通過清除自由基，解除體內產物對成骨細胞的抑制，同時減少自由基對骨膠原分子的破壞使骨有機質恢復，從而恢復骨量。另外，研究發現[13]，維生素C和E與不抽煙的絕經后婦女骨吸收指標 I型膠原羧基末端肽水平呈負相關，可以抑制骨吸收。賈巖波等[14]研究表明，維生素 E可通過促進 bcl-2的表達和抑制Caspase-3的表達來抑制骨細胞凋亡，從而緩解激素所致的骨損傷。此外，有報道[15]，通過基因操作獲得不吸收維生素E的小鼠，結果發現它們的破骨細胞比正常的要小，無法順利吸收骨骼，起到抗骨質疏松作用。本研究結果顯示，維生素 E可使自然生長小鼠的骨密度增加，結構模型指數減少，說明其對自然生長小鼠所引起的骨丟失有一定的預防作用。這可能是因為維生素E可通過抑制自由基，防止骨的變性，使得骨吸收減少，起到防止自然衰老導致的骨量減少，說明維生素E在骨骼生長發育中發揮了積極作用。

3.2 黑芝麻油對自然生長 8月齡小鼠骨代謝的影響

本實驗結束時，Oil組小鼠體重比實驗前有所降低，說明隨著實驗時間增加，黑芝麻油卵磷脂溶液可使自然生長老齡小鼠體重稍有降低。與NS組相比，Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，說明黑芝麻油卵磷脂溶液可以抵抗骨礦物質的丟失。與VE組相比，Oil組骨鈣和骨鎂含量均顯著增加，說明黑芝麻油卵磷脂溶液增加骨礦物質的作用較維生素E強。從Micro CT三維圖可看出，Oil組的骨小梁分布排列緊密，均勻有序且間隙較小，連續性較好，表明黑芝麻油卵磷脂溶液可在一定程度上增加自然生長老齡小鼠股骨的骨量，微觀結構得到改善。與NS組相比，Oil組Conn-Dens顯著增加，而BV/TV、Density均有所增加，但差異無統計學意義，說明黑芝麻油卵磷脂溶液可以改善骨小梁的微觀結構，骨微觀結構得到一定的改善。

黑芝麻含有多種人體必需氨基酸，含有的維生素E和維生素B1能加速人體代謝功能；含有的鐵和維生素E可預防貧血、活化腦細胞、消除血管膽固醇；含有的不飽和脂肪酸，有延年益壽作用[16]。黑芝麻油來源于黑芝麻，從實驗結果顯示黑芝麻油同樣可以預防自然生長致小鼠骨丟失，而增加骨鈣、骨鎂的效果比維生素E更顯著，黑芝麻油預防自然生長致小鼠骨丟失的機制可能與必需脂肪酸有關，可以通過增加維生素D的活性，加強機體吸收腸道的鈣，減少腎鈣的排出，從而使鈣沉積在骨骼，以增強骨的強度。另外，黑芝麻油含有大量如亞油酸、亞麻酸等多種必需脂肪酸，有利于鈣的吸收和促進骨的重吸收，還可促進骨的形成[3]，這都有利于預防骨質疏松。因此推測，黑芝麻油可通過清除自由基，增強機體抗氧化的能力，從而消除自然生長對小鼠骨代謝的不利影響。而其機制可能是黑芝麻油中含有維生素E和不飽和脂肪酸等與成骨細胞、破骨細胞活性的調控有關，但具體機制有待下一步研究。

3.3 小結

自然生長老齡小鼠給予生理鹽水10周后，小鼠股骨的骨量減少，微觀結構受到破壞。黑芝麻油卵磷脂溶液雖不能明顯增加自然生長老齡小鼠股骨的骨量，到可以增加骨鈣和骨鎂的含量，并且可以改善股骨微觀結構，提示具有抗骨質疏松的良好應用前景。