黃芪甲苷葡萄糖注射液抗缺血性心肌損傷的實驗研究※

白 月 李雅楠 袁 煒 牛敏霞 劉文康 黃懷鵬

(河北中醫(yī)學院藥學院2019級碩士研究生，河北 石家莊 050200)

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)主要是由血管狹窄、粥樣硬化或者梗死造成心臟局部血供減少、心肌損傷的一組疾病，包括冠心病、心絞痛、急性冠狀動脈綜合征等[1]。隨著經濟的發(fā)展和人們生活條件的改善，我國IHD的患病率和死亡率持續(xù)上升。最新調查結果顯示，2018年我國冠心病患者約為1100萬，其中每10萬患者就有156.73人死亡[2]。IHD已成為嚴重威脅我國國民健康的主要疾病之一[3]。

中醫(yī)學將IHD歸于“胸痹”“真心痛”范疇。中醫(yī)學認為，氣虛血瘀是胸痹、真心痛的重要病機，氣虛則無力推動血行而致瘀，血瘀又會進一步加重氣虛，形成惡性循環(huán)[4]。血液流變學異常亦是胸痹發(fā)生、發(fā)展的重要原因[5]。缺血、缺氧或腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成酶功能障礙會導致氣虛，進而引起血液循環(huán)功能障礙，最終導致血液流變學異常。中醫(yī)藥在治療IHD方面積累了豐富的經驗。尚云用黃芪湯加減化裁治療冠心病無癥狀性心肌缺血、穩(wěn)定型心絞痛等多種心臟疾病療效顯著[6]。邸海俠等[7]通過對147首治療心肌缺血的方劑進行分析發(fā)現，黃芪的使用頻次位居第二。黃芪被譽為“補藥之長”，具有補氣活血的功效。近年來，黃芪復方及單體成分在IHD方面的應用和療效備受關注。以黃芪為君藥的中藥復方制劑芪參益氣滴丸可通過調控低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路來調節(jié)動物細胞對氧氣的感知和反應，從而對缺血心肌細胞發(fā)揮保護作用[8]。復方黃芪養(yǎng)心合劑可改善氣虛血瘀型冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者的臨床癥狀及中醫(yī)證候積分[9]。現代藥理學研究表明，黃芪含有黃酮類、皂苷類、多糖類等多種有效成分，其中黃芪甲苷為黃芪的皂苷成分，對大鼠缺血心肌具有保護作用[10-11]。黃芪甲苷葡萄糖注射液是以黃芪甲苷為主要成分制成的無菌注射液。本實驗旨在建立多種心肌缺血損傷動物模型，評價黃芪甲苷葡萄糖注射液抗心肌缺血損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠110只，6周齡，體質量18～22 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0020。SPF級SD大鼠160只，8周齡，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006。動物分籠飼養(yǎng)于溫度(23±1)℃、濕度(35±5)%、12 h明暗交替的環(huán)境，自由飲水進食。所有動物實驗均經河北中醫(yī)學院附屬石家莊平安醫(yī)院倫理委員會批準同意(批號：20200805)，并嚴格按照標準執(zhí)行。

1.1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷葡萄糖注射液，由山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司現代中藥研究室提供，規(guī)格：20 mg/100 mL，批號：051001；鹽酸維拉帕米注射液(哈藥集團三精制藥股份有限公司，國藥準字H23020958，規(guī)格：2 mL/5 mg，批號：180921)；硝酸異山梨酯注射液(齊魯制藥有限公司，國藥準字H10960035，規(guī)格：10 mL/10 mg，批號：04110382)；水合氯醛(分析純，天津市光復精細化工研究所，批號：20150622)；鹽酸異丙腎上腺素(ISO，山東科源制藥有限公司，國藥準字H37022268，批號：101443898)。

1.1.3 主要實驗儀器 美國BIC 16導生理記錄儀(美國BIC公司)，血液流變學測試儀(型號：E3-9XW，成都麥賽科貿有限公司)，單道心電圖機(型號：FX-2111，北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司)，多導同步心外膜電圖系統(tǒng)(型號：ALC-EECG，上海奧爾科特生物科技有限公司)，電子秒表。

1.2 方法

1.2.1 耐缺氧實驗

1.2.1.1 常壓耐缺氧實驗 取小鼠50只，隨機分為5組，即溶媒組、維拉帕米組(2 mg/kg)及黃芪甲苷葡萄糖注射液高劑量組(以下簡稱高劑量組，8 mg/kg)、黃芪甲苷葡萄糖注射液中劑量組(以下簡稱中劑量組，4 mg/kg)和黃芪甲苷葡萄糖注射液低劑量組(以下簡稱低劑量組，2 mg/kg)，每組各10只。各組分別予尾靜脈注射相應藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后將各組小鼠放入底部有鈉石灰的廣口瓶(規(guī)格：125 mL，鈉石灰5 g，用于吸收CO2和水)中，密閉(用凡士林涂抹瓶口防止漏氣)，以小鼠腹部無起伏為觀察截點，用電子秒表記錄小鼠從廣口瓶密閉到停止呼吸的時間。

1.2.1.2 心肌缺血小鼠耐缺氧實驗 取小鼠60只，隨機分為6組，即正常組、溶媒組、維拉帕米組(2 mg/kg)、高劑量組(8 mg/kg)、中劑量組(4 mg/kg)和低劑量組(2 mg/kg)，每組各10只。各組分別予尾靜脈注射相應藥液(正常組、溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后，除正常組外，其余5組小鼠參照文獻[12]予ISO 10 mg/kg皮下注射誘導心肌缺血，15 min后將6組小鼠均放入底部有鈉石灰的廣口瓶(規(guī)格：125 mL，鈉石灰5 g)中，用凡士林涂抹瓶口密閉，以小鼠腹部無起伏為觀察截點，用電子秒表記錄小鼠從廣口瓶密閉到停止呼吸的時間。

1.2.1.3 氣管夾閉心電消失實驗 取大鼠50只，隨機分為5組，即溶媒組、維拉帕米組(1 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰位，固定，頸部正中切口，分離氣管，分別尾靜脈注射相應藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，10 min后夾閉大鼠氣管，開始計時，連接心電圖Ⅱ導聯(lián)，至心電圖Ⅱ導聯(lián)持續(xù)出現一平直線記為大鼠心電消失時間。

1.2.2 抗心肌缺血損傷實驗

1.2.2.1 心電ST段總偏移實驗 取大鼠50只，隨機分為5組，即溶媒組、硝酸異山梨酯組(2 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，記錄正常心電圖后，分別尾靜脈注射相應藥液(溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)，給藥10 min后予ISO 6 mg/kg皮下注射，記錄ISO皮下注射后1、5、10、15 min的Ⅱ導聯(lián)心電圖，測量各時間點心電圖的ST段偏移，以1、5、10、15 min的ST段偏移之和作為總ST段偏移幅度(∑ST)。

1.2.2.2 血液流變學實驗 取大鼠60只，隨機分為6組，即假手術組、溶媒組、硝酸異山梨酯組(2 mg/kg)、高劑量組(4 mg/kg)、中劑量組(2 mg/kg)和低劑量組(1 mg/kg)，每組各10只。各組大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，連接生理記錄儀，自大鼠左側3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降支(LAD)，除假手術組外，其余5組在距起點2～3 mm處用6-0帶線縫合針進行結扎，結扎后肉眼可見心尖由紅變白，心電圖Ⅱ導聯(lián)顯示ST段抬高、T波倒置(見圖1)，提示心肌缺血模型建立成功，將心臟送回胸腔，擠出胸腔內血液和氣體，立即縫合胸壁。假手術組不進行結扎，其余步驟同其余5組。各組分別連續(xù)尾靜脈注射相應藥液(假手術組、溶媒組予等容積5%葡萄糖注射液)3 d，末次給藥60 min后，均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血5 mL(麻醉、采血前16 h禁食不禁水)， 50 U肝素抗凝，用血液流變學測試儀測定全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細胞比容。

圖1 心肌缺血大鼠造模前后心電圖

2 結果

2.1 常壓缺氧實驗各組小鼠呼吸時間比較 見表1。

表1 常壓缺氧實驗各組小鼠呼吸時間比較

由表1可見，與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組小鼠呼吸時間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 心肌缺血小鼠耐缺氧實驗各組小鼠呼吸時間比較 見表2。

表2 心肌缺血小鼠耐缺氧實驗各組小鼠呼吸時間比較

由表2可見，與正常組比較，溶媒組和低劑量組小鼠呼吸時間縮短(P<0.05)。與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組小鼠呼吸時間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 氣管夾閉心電消失實驗各組大鼠心電消失時間比較 見表3。

表3 氣管夾閉心電消失實驗各組大鼠心電消失時間比較

由表3可見，與溶媒組比較，維拉帕米組、高劑量組及中劑量組大鼠心電消失時間均顯著延長(P<0.05)。維拉帕米組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 心電ST段總偏移實驗各組大鼠∑ST比較 見表4。

表4 心電ST段總偏移實驗各組大鼠∑ST比較

由表4可見，與溶媒組比較，硝酸異山梨酯組、高劑量組及中劑量組大鼠∑ST均明顯降低(P<0.05)。硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組及低劑量組組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 血液流變學實驗各組大鼠血液流變學指標比較 見表5。

由表5可見，與假手術組比較，溶媒組和低劑量組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細胞比容均升高(P<0.05)。與溶媒組比較，硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細胞比容均降低(P<0.05)。硝酸異山梨酯組、高劑量組、中劑量組及低劑量組全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細胞比容組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 血液流變學實驗各組大鼠血液流變學指標比較

3 討論

黃芪屬膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，具有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌等作用，常用于氣虛乏力、久瀉脫肛、自汗、瘡口久不愈合等。補氣生血經典名方當歸補血湯由黃芪、當歸5∶1組成，主治血虛陽浮發(fā)熱證。現代醫(yī)學研究發(fā)現，當歸補血湯治療心血管系統(tǒng)疾病效果突出，包括抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血、促進血管新生等[13]。基于數據挖掘對國醫(yī)大師劉祖貽561首含黃芪處方用藥規(guī)律研究發(fā)現，黃芪不同用量及多種配伍靈活應用可治療多種病癥[14]。

黃芪甲苷作為黃芪皂苷類成分之一，被視為黃芪質量控制的生物標志物[15-16]，具有抗炎、抗氧化應激、強心降壓及增強免疫力等藥理作用[17]，在治療心腦血管疾病方面應用廣泛且取得一定成果。研究發(fā)現，黃芪甲苷可降低心肌梗死大鼠的梗死面積，通過抗炎、抗心肌纖維化改善大鼠急性心肌梗死后的心室重構[18-19]。黃芪甲苷可激活HIF-1α信號，減輕心肌缺血再灌注損傷[20]，亦可通過抗心肌細胞凋亡、抗氧化應激等發(fā)揮保護心肌作用[21]。此外，黃芪甲苷在改善血管內皮損傷、保護腦神經及腦血管等方面亦發(fā)揮著重要作用[22]。

心肌缺血時，心肌細胞缺氧及各種營養(yǎng)物質供應不足，出現代謝異常和代謝產物異常堆積，最終致心肌細胞死亡。心臟缺血導致大鼠心臟組織細胞的缺氧，是一個基本的和重要的病理生理環(huán)節(jié)。同時，心肌缺血的形成與血液流變異常有密切聯(lián)系，血液黏度升高使血流阻力增加，流速減慢，甚至造成血液停滯，最終影響冠狀動脈供血，誘發(fā)或加重心肌缺血[22]。因此，提高心肌的耐缺氧能力及改善血流狀態(tài)為防治缺血性心臟病的基礎。本研究結果顯示，在耐缺氧實驗中，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組均可不同程度地延長正常小鼠和ISO誘導的心肌缺氧小鼠在密閉缺氧條件下的存活時間(P<0.05)，提示黃芪甲苷葡萄糖注射液可增強小鼠心臟在缺氧狀態(tài)下的耐受性。在氣管夾閉狀態(tài)下，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組大鼠心電消失時間顯著延長(P<0.05)，提示黃芪甲苷葡萄糖注射液能提高小鼠心肌細胞抗缺血缺氧的能力，可有效保護心肌細胞。

心電圖ST段變化是判斷心肌缺血與否的主要指標[3]。本實驗中，與溶媒組相比，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組心電圖∑ST顯著降低(P<0.05)，提示該藥物可改善缺血心肌細胞的功能，保護缺血心肌。血液流變學作為血脈痹阻的客觀指標，其異常多與穩(wěn)定型心絞痛痰瘀有關，臨床上表現為高黏度、高凝聚狀態(tài)及血小板聚集率增高等[23]。本實驗結果表明，與心肌缺血大鼠溶媒組相比較，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量組全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度和紅細胞比容均明顯降低(P<0.05)。證明黃芪甲苷葡萄糖注射液可改善心肌缺血大鼠的血液流變學指標。

綜上所述，黃芪甲苷葡萄糖注射液中、高劑量可改善模型動物的心肌缺血，其抗心肌缺血作用可能與增強心肌細胞耐缺氧能力、改善心肌缺血模型血液流變性有關。