高效親水作用色譜-蒸發光散檢測應用于甘油磷酸膽堿含量測定

婁良(中山百靈生物技術股份有限公司，廣東 中山 528437)

0 引言

甘油磷酸膽堿(glycerylphosphorylcholine，簡稱GPC)是一種重要的藥物原料。GPC的分子式為C8H20NO6P，是有甘油分子和磷酸膽堿基團脫去水分子構成，是重要的神經傳遞質乙酰膽堿的生物合成前體。GPC能在小腸和通過靜脈注射吸收，并且能進入脂蛋白的結構中[1]，因此具有藥用價值。研究表明，GPC有保肝作用[2]，有改善老年人認知能力和記憶力的作用[3]，還有多種健腦功效，因此GPC在食品、藥品、化妝品領域具有重要應用價值。

GPC含量檢測方法的研究有許多。早在1985年，Joseph J Billadello等[4]研究了用核磁共振磷譜對完整組織中GPC的含量進行測定，該方法回收率較高，但靈敏度低，重現性差。程琳等[5]研究了液質聯用法，該方法能快速測定GPC的含量，且靈敏度高，穩定性好，但因檢測成本高導致該方法應用范圍不廣。

本研究采用HPLC-HILIC-ELSD方法檢測GPC的含量，色譜柱為Venusil HILIC色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(以乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8，流速1.0 mL/min，ELSD檢測器，漂移管溫度70 ℃。該方法分析速度快，15 min即可完成單個樣品分析；主要物質GPC與其他雜質的分離度良好；log峰面積與log進樣量的線性關系良好，用外標兩點法對GPC進行定量結果準確；方法重現性好，該方法可用于GPC的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀器(島津CBM-20A)、蒸發光散射檢測器(島津ELSD-LTII)、分析天平(賽多利斯BT125D)、Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

試劑：蒸餾水、甘油磷酸膽堿標準品(含量99.5%韓國藥典標準品)、甘油磷酸膽堿供試品(中山百靈生物技術有限公司批號GP20630-GP20632)、乙腈(色譜純，阿拉丁)、乙醇(色譜純，阿拉丁)、乙酸銨(分析純，阿拉丁)。

1.2 色譜分析條件

高效液相系統：島津LC-20AT、等度洗脫、流速1.0 mL/min、色譜柱Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5μm)、柱溫40 ℃、進樣量20μL、蒸發光散射檢測器、漂移管溫度70 ℃、增益2(×2)、過濾器10sec、流動相為0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8。

1.3 GPC含量測定

取甘油磷酸膽堿(GPC)對照品適量，精密稱定，用流動相稀釋定容，配制成濃度為0.1 mg/mL和1 mg/mL的GPC對照溶液。

取甘油磷酸膽堿(GPC)供試品適量，精密稱定，用流動相稀釋定容，配制成濃度為0.5 mg/mL的GPC供試品溶液。

精密量取GPC對照溶液及GPC供試品溶液各20 μL進樣。

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2 結果與討論

2.1 色譜分析條件確定

2.1.1 色譜柱及分離體系選擇

由于甘油磷酸膽堿(GPC)是水溶性且極性非常大的物質，在普通RPLC-C18體系上保留時間非常短，而GPC樣品的水溶性無法選擇普通的正相體系。綜上所述，選擇親水作用色譜(HILIC)模式，通過對不同品牌以及不同填料的HILIC色譜柱進行篩選，最后發現丙烯酰胺鍵合硅膠填料的HILIC色譜柱對GPC及其雜質有較好的分離效果以及重現性，最終選擇Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱。

2.1.2 流動相選擇

根據親水色譜模式的流動相選擇以及樣品性質，分別篩選了甲醇-水、乙腈-水、緩沖鹽-甲醇-乙腈體系，根據樣品分離效果、保留時間以及響應值，最終選擇0.05 mol/L乙酸銨水溶液-(乙腈-甲醇=6∶4)=2∶8作為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，下圖1為GPC的HPLC圖譜。GPC分離度大于2.0，GPC保留時間為6.662 min，可以在15 min以內快速完成樣品的分析。

圖1 GPC的HPLC圖譜

2.1.3 蒸發光散射檢測器參數的優化

ELSD作為一種通用型質量檢測器，待測物經色譜分離后進入霧化器，霧化為很小的顆粒，這些霧化顆粒進入漂移管，揮發性流動相氣化蒸發，剩余的微小顆粒通過光束時產生光散射效應。本實驗優化了漂移管溫度、增益以及過濾器等參數并以氮氣為載氣，結果表明60～90 ℃時響應值最高。漂移管溫度過高會縮短檢測器壽命，因此設置漂移管溫度為70 ℃，增益2(×2)，過濾器10sec。

2.2 檢測限和定量限

取甘油磷酸膽堿(GPC)適量，加流動相定量稀釋后進樣，記錄色譜圖。以信噪比約為3∶1的濃度作為檢測限，信噪比約為10∶1的濃度作為定量限。實驗結果表明以信噪比約為3∶1時的濃度作為檢測限，甘油磷酸膽堿(GPC)的檢測限為0.005 9 mg/mL，相當于樣品濃度的1.2%，以信噪比約為10∶1時的濃度作為定量限，甘油磷酸膽堿(GPC)的定量限為0.011 mg/mL，相當于樣品濃度的2.2%。

2.3 線性范圍

2.3.1 線性溶液的配制

精密稱取100 mg甘油磷酸膽堿(GPC)標準品于50 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，制成2 mg/mL的母液。分別精密移取0.5、0.75、1.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL母液于10 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，得到濃度分別為0.1、0.15、0.3、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的GPC標準液。

2.3.2 線性回歸

取2.3.1中配制好的GPC系列標準液，分別進樣20 μL，以保留時間定性，峰面積定量。以各GPC標準液的log峰面積為縱坐標Y，以該溶液的log進樣量為橫坐標X，進行線性回歸，得到相應線性回歸方程為y=1.374 9x+3.377 3(r=0.999 9)，說明甘油磷酸膽堿(GPC)在0.1～1.4 mg/mL范圍內線性良好。甘油磷酸膽堿(GPC)線性回歸圖見圖2。

圖2 甘油磷酸膽堿(GPC)線性回歸圖

2.4 溶液穩定性試驗

取甘油磷酸膽堿(GPC)標準品適量，精密稱定，用流動相稀釋定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的GPC標液，每2 h進樣1次分析，共測定6次，實驗周期為12 h，結果表明計算GPC標液在12 h內穩定性好，峰面積計算RSD為0.65%。

2.5 精密度以及方法回收率

2.5.1 重現性

配制的濃度為0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的GPC系列標準溶液，分別進樣20 μL，每個溶液連續進三次。三個濃度下的9次連續進樣的GPC響應值Rf(log進樣量/GPC log峰面積)RSD為0.58%，結果小于2.0%，說明該方法的重現性好。

2.5.2 中間精密度

不同日期不同檢測人員重復重現性實驗結果，GPC響應值(log進樣量/GPC log峰面積)RSD為0.88%，結果小于2.0%，說明該方法中間精密度好。

2.5.3 方法回收率

取已知甘油磷酸膽堿(GPC)含量的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品6份，精密稱定，加入甘油磷酸膽堿(GPC)對照品0.5 mg/mL，用流動相溶解混勻后按1.2項下的方法進行測定，記錄色譜圖。實驗結果表明6份樣品加入同一濃度回收溶液得到甘油磷酸膽堿(GPC)的回收率均在98%～101%之間，且RSD＜1.0%，說明該方法準確性良好。

2.6 樣品分析

取三個批號(GP20630、GP20631、GP20632)的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品按照本方法所述操作進行甘油磷酸膽堿(GPC)供試品含量測定，GP20630、GP20631、GP20632三個批號的甘油磷酸膽堿(GPC)供試品含量測定結果分別為98.0%、98.3%、98.2%。

3 結語

文章選用親水作用色譜法配合ELSD檢測器，建立了利用高效液相色譜快速測定樣品中GPC含量的檢測方法。相對于其他主流分析方法，該方法適用范圍更廣且穩定性好，可以適用于各種復雜樣品中GPC含量分析，操作簡便、快捷，并且該方法還能有效地提高檢測靈敏度和準確性。