應用母血漿中胎兒游離DNA進行無創性產前診斷的臨床分析

奉 淼

（遼寧省葫蘆島市中心醫院，遼寧 葫蘆島 125001）

現如今，中國每年新生兒出生缺陷人數為80萬～120萬。利用有效方式做好產前篩查以及診斷工作，能夠有效減少先天性缺陷新生兒出生率。但值得注意的是，迄今為止臨床中較為常用的診斷方式均為有創性檢查。實施有創性檢查令孕婦以及胎兒均承擔了一定風險。由此能夠看出，研究出一類新式的無創診斷方式，意義重大[1]。

在20世紀90年代末，國外學者發現于孕婦血漿內存在少量游離性胎兒DNA，其也為非有創性產前診斷方式提供了新路徑。

懷孕者可從孕7周起檢測到cffDNA（孕婦胎兒游離DNA），在妊娠的最早3個月內，該項指標含量水平每周大約遞增21%。在此之后進入到平臺期，并于分娩前急劇增加，產婦分娩之后2 h內馬上消失。開展cff DNA檢查具有相當重要的現實意義。并且這種診斷方式不會受到妊娠者是否為經產婦的干擾。由此能夠看出，測定孕婦血漿內的cffDNA為實施非有創性產前診斷的理想化指標。結合實際情況，本文全面探究應用孕婦血漿中胎兒游離DNA無創性產前診斷的價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年9月至2019年9月來本院產前診斷中心接受產檢的1 708例孕婦為研究對象，所有受試者年齡以及孕周情況見表1。

表1 受試者年齡以及孕周情況比較

進行此項檢查的適應證：唐篩高風險者；經超聲檢查顯示為胎兒畸形者；年齡35歲以上者；孕早期曾經使用過制劑藥物或者存在病毒感染者引致畸形者；曾經生育過染色體異常者；非確定性原因致使胚胎停育、反復性流產、死胎、死產者、羊水異常者；存在染色體異常家族史者或者夫妻任何一方存在染色體異常者。

1.2 方法

1.2.1 胎兒游離DNA檢測方式 抽取受試者10 mL外周血。將其放入到EDTA抗凝試管之內。完成樣本收集工作以后，于4 ℃環境下實施血漿分離工作。提取出胎兒游離DNA，實施PCR擴張，獲取與之對應的DNA文庫。

試驗經過高通量測定的辦法，全面分析測序結果生物學信息。精準計算相關樣本待檢測染色體比例和人群比率情況后除以對照組待檢測樣本染色體方差。得出Z值。倘若Z值在3以上，就可被認定為樣本為三體高危；若該值在3以下，則應認定為單體高危[2]。

針對于結果為高危的受試者，實施取樣穿刺工作。針對其染色體核型加以確診與分析。若提示正常，應當對受試者進行隨訪和跟蹤。

1.2.2 羊水染色體核型分析方式 利用超聲開展引導工作。常規性消毒，通過穿刺針經腹壁和子宮直至羊膜腔，抽取共計20 mL羊水，離心處理[3]。取出0.50 mL沉淀物質，混合均勻之后將其放入到內含羊水培養基的實驗瓶內。后放置到內部含有濃度為5%的二氧化碳、37 ℃環境下培養箱內進行開放式培養。數天后，更換培養液，繼續進行該項工作。如果觀察羊水細胞生長滿意，應當在實驗瓶中加入適當秋水仙素，令細胞分裂停滯于中期。在此之后，于37 ℃環境下進行低滲處理，并開展固定、制片、顯帶、染色。利用這種方法取得用于染色體核型分析的細胞樣本。在此之后，開展核型分析以及技術工作。

2 結果

在所有母血胎兒游離DNA測試結果之內，共計28例染色體異常，風險率為1.64%。在此其中，2例染色體多態、8例18-三體高危、16例21-三體高危以及4例性染色體高危與最終羊水染色體核型分析結果相同。有2例經測序結果證實為47，某受試者通過羊水染色核型分析結果正常。對此次試驗判定為低風險者進行妊娠結局隨訪，沒有發現漏診、誤診案例，準確率達到了99.99%。胎兒游離DNA檢驗和核型分析結果對比見表2。

表2 胎兒游離DNA檢驗以及核型分析結果對比

3 討 論

長久以來，諸多學者試圖尋找一種微創或無創的方法獲取胎兒DNA，并將其視為產前診斷的重要依據[4]。在開展此項工作中，學者們首先將研究重點集中在應用有效方法取得胎兒細胞方面。早在20世紀60年代末，就有學者指出在母體血液循環內可能會存在胎兒細胞。此報道一經公布，為無創性獲取胎兒細胞奠定了重要基礎。

在20世紀90年代中期，富集與分離胎兒細胞的密度梯度離心技術以及流式細胞技術就已成型。其為日后所開展的FISH與PCR技術提供了無限可能。而在1997年，國外學者也尋找出了直接取得胎兒DNA的有效方式。這也為無創性產前基因診斷開辟了新的道路[5]。

除經過Y染色體序列測定能夠診斷連鎖遺傳病之外，有很多學者在極短時間內創建了RhD基因檢測。針對于RhD結果為陰性的受試者，倘若其自身血漿或者血清內存在胎兒RhD序列，則代表其非常可能是一個RhD陽性胎兒。該類方法已然被諸多研究小組所運用。這些學者把RhD基因不同的區域視為靶區列。其也在根本上證實了這種方法可靠性高[6]。

另外，也有很多學者的研究重點為針對母親血漿內源父源多態性微小衛星序列加以檢測。有學者報道，通過熒光PCR測定到了可疑患兒攜帶21、18以及13染色體中的多態性微小衛星序列，經過予以女胎同時攜帶父源性位于X染色體上的多態性微小衛星序列為女胎DNA特異化標志物。針對于妊娠末期以及中期受試者血漿內游離胎兒DNA開展熒光標記PCR處理，其檢出率分別達到了71%以及80%[7-8]。

正因為如此，這些方式也被很多學者應用在單基因病產前診斷方面[9]。軟骨發育不全為一類先天性畸形。該疾病患者基因突變點大都位于編碼成纖維細胞生長因子受體3的1138bp位置。利用PCR和限制性片段長度多態性加以分析，可實現針對于母血漿內胎兒來源基因突變檢測。進而令該檢測方式針對于此類疾病實施單基因無創性產前診斷變為現實[10]。

相關研究指出[11]，疑似21-三體胎兒孕母血漿內的胎兒DNA水平增高。可見，利用測定母體血漿內胎兒DNA的方式，能夠針對于腹內胎兒非整倍體疾病加以篩查。

在本實驗內利用了高通量基因測序法，實現對母體血漿胎兒游離DNA實施無創性檢查。有效樣本共計1 078例。共計檢出28例染色體異常。風險率為1.64%。2例受試者通過測序結果顯示為47。而某受試者進一步實施羊水染色體核型分析，顯示結果為正常。

有報道指出[12]，利用高通量測序法可以精準的測定出18-三體以及21-三體發生情況。和既往核型分析法相比，這種技術可以在極大程度上減少孕婦流產風險，同時也能夠緩解其內心負擔。

但值得注意的是，此類方式針對于性染色體檢測穩定度存在局限性。之所以出現這種情況，非常可能和受試者本身游離性DNA水平過高存在相關性。另外造成這種情況出現的原因也可能和PCR擴增、高CG水平存在關聯性。

總而言之，在受試者孕中期，為其開展無創性母血胎兒游離DNA檢測，對于檢出腹內胎兒染色體非整倍體情況結果可靠。但值得注意的是，其在測定染色體非整倍體胎兒無創性檢查方面。有假陽性可能。因此還需要進一步完善有關實驗方法，以全面提升檢測精準率。