響應面優化血根堿β-環糊精包合物的制備工藝

梁浩 錢璽丞 杜曉靜 郁建生

摘??? 要：本研究旨在制備血根堿β-環糊精包合物，從而拓寬其應用范圍。首先通過單因素試驗對條件進行優化，隨后再以包合率考察指標，采用響應面法對包合比、包合溫度、包合時間3個因素進行優化，確定最佳的工藝參數。結果表明：包合時間140 min，包合比7∶1，包合溫度62 ℃時包合率達到56.05%，與軟件預測值（56.11%）接近（相對誤差0.11%）。

關鍵詞：β-環糊精;血根堿;響應面分析法

中圖分類號：TS201.1????????? 文獻標識碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.02.001

Response Surface Optimization of the Preparation Process of Sanguinarine β-cyclodextrin Inclusion Compound

LIANG Hao， QIAN Xicheng， DU Xiaojing， YU Jiansheng

（Key Open Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine， Tongren Polytechnic College， Tongren，Guizhou? 554300， China）

Abstract： This study aims to prepare sanguinarine β-cyclodextrin inclusion compound to broaden its application range. Firstly， the conditions were optimized through single factor test， and then the indicators were investigated by inclusion rate. The response surface method was used to optimize the inclusion ratio， inclusion temperature， and inclusion time to determine the best process parameters.The results showed that when the inclusion time of the inclusion reaction was 140 min， the inclusion ratio of β-cyclodextrin and sanguinarine was 7∶1， and the temperature of the inclusion reaction was 62 ℃， and the inclusion rate reached 56.05% ， which was close to the software predicted value （56.11%） （relative error 0.11%）.

Key words： β-cyclodextrin; Sanguinarine; response surface methodology

血根堿是一種苯并菲啶型的異喹琳類生物堿，主要存在于紫堇的根塊、血水草的地上部分以及白屈菜和博落回的全草之中[1-8]。研究表明具有多種藥理活性（抗腫瘤、抗炎、抗菌等）[9-11]，在生物醫藥、獸藥和植物源生物農藥方面應用廣泛[12-18]。此外，血根堿還具有一定的清除自由基功能，因此可作為一種潛在的天然食品抗氧化劑[19]。但由于血根堿在水中的溶解度和穩定性較差，限制了其應用范圍。環糊精包合技術能很好地解決這一難題，不僅可以增加客體分子的水溶性，還可以降低其自身的毒性，掩蓋其苦味，防止客體分子在加工和貯存過程中變質等[20]。目前苯并菲啶型生物堿的環糊精包合物主要集中在對小檗堿的包合，以掩蓋其苦味，對血根堿的包合作用研究較少[21-24]。因此，本試驗主要研究了β-環糊精對血根堿的包合作用，以期改善其溶解性和穩定性，從而拓寬其應用范圍。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與儀器

血根堿原料（HPLC檢測純度為95.5%），參照文獻[25]自制，血根堿標品（純度≥98%;上海源葉生物科技有限公司）和β-環糊精（純度≥98%;上海源葉生物科技有限公司）;其它常規試劑為分析純購自國藥試劑。

超高效液相色譜儀（型號：Agilent1290）購自安捷倫;真空干燥箱（型號：FZG-1）購自南京華莎;十萬分之一分析天平（型號：CPA225D）購自賽多利斯;千分之一分析天平（型號：AE224）購自上海舜宇;磁力攪拌器（型號：DF-101S）購自鞏義予華;紫外可見分光光度計（型號：T10CS）購自北京普析;超聲波清洗機（型號：SG5200HE）購自上海冠特;鼓風干燥箱（型號：DHG-9140B）購自上海福絮。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 溶液制備：稱取10.29 mg血根堿標準品，用甲醇-1.0%鹽酸溶液（50∶50）溶解，超聲30 s，采用100 mL容量瓶定容，配置得到血根堿標準溶液母液。準確量取標準品母液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL于容量瓶（50 mL）中，并定容。

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18 型超高壓快速高分離度窄徑柱（2.1*50， 1.8 μm）色譜柱，波長271 nm;流動相0.1%磷酸-乙腈;柱溫25℃;進樣量 2 μL;流速 0.5 mL·min-1。

標準曲線繪制：橫坐標X軸為血根堿濃度，縱坐標Y軸為峰面積，繪制標準曲線（圖1）。該曲線在 0～20 μg·mL-1范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=-0.589 14+14.956 9x，R2=0.999 93。

1.2.2 血根堿-β-環糊精包合物制備 稱取一定量β-CD，加入5 mL蒸餾水，水浴加熱攪拌至溶解，緩慢加入0.1 g血根堿，避光攪拌，攪拌結束后將反應液冷藏過夜，過濾反應液，濾餅用蒸餾水洗滌，濾餅40℃真空干燥，粉碎后即得包合物粉末。

1.2.3 血根堿β-環糊精包合單因素試驗 包合溫度：固定反應的包合時間和包合比，以包合率為指標，包合溫度分別30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，確定較佳包合溫度。

包合時間：固定反應的包合比和包合溫度，以包合率為指標，包合時間分別1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，確定較佳包合時間。

包合比：固定反應的包合時間和包合溫度，以包合率為指標，包合比分別1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，確定較佳包合比。

1.2.4 包合物制備工藝的響應面優化 結合單因素試驗結果，以血根堿包合物包合率（Y）為評價指標，考察包合比（X1）、包合時間（X3）和包合溫度（X2）這3個因素，通過優化Box-Behnken響應面分析確定最佳的血根堿包合參數，試驗設計中的水平及編碼值見表1。

1.2.5 樣品溶液的配制及含量測定 準確稱取血根堿包合物，采用1.0%鹽酸-甲醇溶液（50∶50）溶解，超聲30 s，定容于25 mL容量瓶中，搖勻，采用有機溶劑微孔濾膜（0.22 μm）過濾，得待測包合物樣品溶液。采用高效液相色譜法（檢測波長271 nm）測定包合物中血根堿含量。血根堿包合率= 1-（濾液中血根堿質量+包合物中未反應血根堿質量）/稱量血根堿質量×100%。

1.2.6 數據處理與分析 單因素試驗均重復3次取平均值，試驗數據采用OriginPro 9.1 軟件進行統計與分析，響應面試驗數據采用Design-Expert 8.0.6.1軟件統計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 β-環糊精與血根堿的配比對包合反應的影響 采用單因素方差分析通過包合比對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=0.009 4達到極顯著水平（P<0.01），由圖2可知，血根堿的包合率隨β-環糊精與血根堿的包合比的增大而增大，當包合比為6∶1時包合率達到最大值38.6%，繼續增大包合比，包合率減小，因此選擇包合比為6∶1。

2.1.2 攪拌反應溫度對包合率的影響 采用單因素方差分析通過包合溫度對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=0.005 7達到極顯著水平（P<0.01），由圖3可知，包合溫度較低或較高時包合比都會降低，可能是溫度較低不利于血根堿進入環糊精內部的空腔結構，溫度過又會導致已經形成的包合物分解。因此選取包合溫度為60℃。

2.1.3 包合時間對血根堿包合率的影響 采用單因素方差分析通過包合時間對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=5.24×10-6達到極顯著水平（P<0.01），由圖4可知，包合時間過長或過短時均不利于包合物的形成，當包合時間為2 h時包合率達到最大值，可能是由于包合時間縮短血根堿的包合反應過程尚未完成，時間太長又會導致以形成的包合物脫包合。因此選擇2 h為包合時間。

2.2 響應面試驗

2.2.1 試驗結果與分析 響應面試驗數據采用Design-Expert8.0.6.1軟件分析，試驗結果見表2，建立數學模型方程為：Y=53.44+2.78X1-0.23X2+4.25X3+2.52X1X2+4.43X1X3-0.34X2 X3-3.60X12-3.15X22-6.34X32。

方差分析結果見表3。該模型P值達到極顯著水平，二次項均顯著，說明方程與試驗擬合度較好。模型方差分析表明，各影響因素對血根堿的包合率影響次序為：包合時間>主客分子包合比>包合溫度。

2.2.2 包合工藝的響應面交互作用分析 圖5為β-環糊精與血根堿包合工藝的響應面分析圖。由圖5 可看出，X1和X3的交互作用對包合率影響極顯著，X1X2和X2X3對包合率的影響不顯著。根據響應面分析得到的最佳包和參數為包合比6.91∶1，包合時間2.32 h，包合溫度61.82℃時包合率的理論最大值為56.11%。

2.2.3 血根堿與β-環糊精環糊精包合工藝驗證試驗 考慮到實際操作的局限性，因此將包合工藝的參數進一步修訂，包合比修訂為7∶1，包合時間修訂為140 min，包合溫度修訂為62℃，將此條件重復三次取平均值，包合率達到56.05%與預測值相對誤差為0. 11%。由此可知，理論值與實際值誤差在± 1%以內，說明采用Box-Behnken組合優化得到的包合參數準確可靠，可以較好地反應β-環糊精與血根堿的包合情況，具有一定的應用價值。

2.3 血根堿包合物的紫外光譜分析

在200～400 nm波長條件下，分別對四種不同溶液（血根堿標準品溶液、β-環糊精樣品溶液、包合物溶液、混合物溶液）進行紫外掃描，其紫外光譜如圖6所示。由圖可知，包合物的紫外吸收波峰和波谷與β-環糊精、血根堿以及兩者的物理混合物的波峰和波谷的吸收波長均有所差異，因此可判定得到的不是血根堿與β-環糊精的簡單混合物（不同物質的紫外吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異），因而初步驗證了血根堿-β-環糊精包合物已形成。

3 結論與討論

近年來環糊精包合技術在制藥工業中應用越來越多，經環糊精包合以后，不僅可以延長延誤的貨架期，改善藥物的口感提高適口性。還可以提高藥物的溶解度、生物利用度、控制藥物的釋放、還可以實現靶向治療等[26]。目前環糊精對小檗堿的包合作用已被多人報到，經包合以后小檗堿的溶解性和苦味都有所改善，血根堿與小檗堿同屬苯丙菲啶型生物堿，結構相似，因此環糊精對血根堿的包合作用應該也能實現。通過環糊精對血根堿的包合，以期改善其穩定性和溶解性。

本研究通過單因素試驗確定了β環糊精和血根堿的包合比為6∶1，包合溫度為60℃、包合時間為2 h。再通過用Box-Benhnken 設計3因素3水平的響應面試驗，得到了β環糊精和血根堿的最佳包合工藝：包合比7∶1、包合溫度62℃、包合時間140 min，包合率達到56.05%。經紫外光譜初步鑒定，包合物已形成，本試驗通過響應面優化得到的試驗數據可靠，理論值與實際值相差不大，因此該工藝具有很好的應用價值，可為血根堿新型制劑的開發提供技術支持。

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