四川烤煙赤星病的生物學特性及藥劑篩選

李茂業 閆芳芳 劉蘇 謝云波 徐傳濤 李斌 江連強 何佶弦 劉明科 楊洋

摘? 要：為明確四川烤煙赤星病發生規律和生物學特性并篩選高效防治藥劑，連續3年在四川省瀘州市、涼山州、攀枝花市、廣元市、宜賓市等5個主要植煙區對煙草赤星病發生情況進行調查，并在煙葉成熟期采集典型患病煙葉進行病原菌分離培養，通過宏觀形態學、顯微形態學及分子生物學鑒定其種類并測定菌落生長速率和萌發率，同時在煙田開展煙草赤星病高效防治藥劑篩選。結果表明，5個煙區采集的赤星病樣均屬于鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌，各煙區所采集分離的赤星病菌在SDAY培養基上菌落直徑、產孢量和萌發率差異均不顯著。5個煙區均發生煙草赤星病，整體發病規律為：每年6月底至9月初，煙田病情指數隨著時間的推移逐漸增加，每年8月份，5個植煙區煙草赤星病病情指數顯著高于7月份并趨于峰值。10%苯醚甲環唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對煙草赤星病均有較好的防治效果（防效均大于60%）。

關鍵詞：煙草赤星病菌;發生規律;生物學特性;高效藥劑

Abstract： In order to determine the periodic occurrences， biological characteristics and high effective fungicides of tobacco brown spot disease in Sichuan Province， systematic investigation was carried out to study the occurrence of brown spot of tobacco for three consecutive years in 5 major planting areas of Sichuan Province including Luzhou， Liangshan， Panzhihua， Guangyuan and Yibin. Tobacco samples with typical symptoms of brown spot were collected at maturity. To identify the causal species of the disease， colonies isolated from brown spot-infected tobacco were studied using macromorphology， micromorphology and molecular biology methods and growth rate and germination rate determined. At the same time， the screening of high efficiency emergency chemicals for brown spot of tobacco was conducted in tobacco fields. The results showed that the causal pathogens identified from tobacco samples with typical symptoms of brown spot from the 5 major planting areas of Sichuan Province were all Alternaria spp. There were no significant difference in colony diameter， spore production and germination rate among the isolates of Alternaria spp. on SDAY media. The disease index of Alternaria spp. increased gradually with time from the end of June to September every year in the 5 growing areas of tobacco. In August of every year， the disease index of Alternaria spp. in the 5 growing areas of tobacco was significantly higher than that in July and reached a peak. 10% Difenoconazole water dispersible granule and 40% mycelium net wettable powder had good control effects to control Alternaria spp of more than 60% which was stable among the 5 growing areas.

Keywords： tobacco brown spot disease; periodic occurrences; biological characteristics; high efficiency pesticides

煙草真菌侵染性病害是煙草上的重要病害，給煙農造成巨大經濟損失[1]。由鏈格孢菌引起的煙草赤星病是主要真菌性病害，該病害不僅侵染煙草葉片，還侵染煙株莖、花梗等部位，其發生特點為潛育期較短、傳播速度快[1-2]。有學者統計，煙草赤星病在中國每年發生的面積達數十萬公頃，造成的經濟損失達上億元人民幣，煙草赤星病防治成為目前煙草生產中的重要任務[3-4]。

煙草赤星病以菌絲越冬，為弱寄生菌，在寄主和環境適宜時，可以多次侵染致使其爆發流行。赤星病爆發流行與濕度、溫度等環境因素和寄主本身抗性及生育期具有相關性。四川省為我國烤煙的主要產地之一，目前每年種植面積達8萬hm2左右。四川省各植煙區生態類型不同，每年各植煙區均報道有赤星病的發生，一般在煙草生長成熟期病株率達40%以上，嚴重制約了省內烤煙的可持續發展。目前，有關四川省不同生態類型植煙區赤星病的發生分布特征、生物學特性及高效防治藥劑的報道較少。本研究通過調查四川省不同植煙區赤星病發生分布特征，采集發病煙葉并進行分子鑒定，觀察赤星病菌生物學特性，同時針對不同植煙區篩選高效防治藥劑，以期為赤星病的防治提供理論和技術支持。

1? 材料與方法

1.1? 赤星病調查與樣品采集

試驗于2017—2019年6—9月開展，在四川省瀘州市、涼山州、攀枝花市、廣元市、宜賓市5個主要植煙區對煙草赤星病發生情況進行定點系統調查，每個煙區選擇具有代表性的3個田塊，每個田塊選擇100株煙，每周調查1次。在煙葉成熟時采集病斑呈圓形或近圓形、具有顯著褐色同心輪紋并附有黑色霉層的赤星病典型癥狀的煙葉樣品，同時記錄采集時間和發病率等信息。

1.2? 赤星病病原分離純化和分子鑒定

將赤星病典型癥狀煙葉用無菌水洗去表面異物，用無菌剪刀剪下病斑組織，在無菌操作臺上， 75%酒精浸泡消毒2～3 s，0.1%升汞溶液浸泡消毒2～3 min，無菌水沖洗3次，吸干病斑組織表面水分，置于SDAY培養基上培養[（26±1）℃，每天光照16 h]，至菌絲長出，用無菌接菌針挑取菌絲在新的SDAY培養基平板上純化，直至獲得單個菌落。

將獲得的單孢菌株在SDAY培養基上培養4～6 d后，利用基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA;采用通用引物，上游引物PCRA-F：CTCCGAATTCTACGGACGCAAGCCGGAAGGAACC，下游引物PCRA-R：GTCGCTAACCTTCTG CTTCAGGAGCAGACCGCTG，以基因組DNA模板進行PCR擴增，將擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測得的實驗菌株序列結果在GenBank數據庫用BLAST進行序列比對，分析其分類地位。

1.3? 病原菌生物學特性測定

將采集自四川省各市州的煙草赤星病菌株接至SDAY培養基上，在人工氣候培養箱中培養，每天利用直尺采用十字交叉法測量各菌株生長直徑，連續測量5 d。當培養至第10天時采用血球計數板測量菌落單位面積的產孢量。用無菌水將孢子稀釋為1.0×106 cfu/mL的懸浮液，用移液槍吸取15 ?L滴在含SDAY固體培養基的載玻片上，將載玻片置于（25±1） ℃的無菌環境下培養18 h后，用顯微鏡隨機鏡檢5個不同視野，記錄孢子萌發率。

1.4? 田間藥劑篩選

于2019年6月25日在各煙區進行藥劑篩選試驗。設5個藥劑處理，以清水作為對照（表1）。每處理設3次重復，每個重復100 m2。發病初期，每10 d施藥1次，連續施藥3次。分別于第1次施藥前1 d、第1次施藥后7 d和第3次施藥后7 d進行3次調查。每處理定點調查小區中間的100株，外圍煙株視為保護行。按病情分級標準，記錄并計算各處理組煙株發病率、病情指數和相對防治效果。

1.5? 數據統計與分析

菌株生長速率、萌發率、藥劑防效等采用Excel 2019軟件進行統計，DPS進行方差分析，Duncans新復極差法進行多重比較。差異顯著性水平設為p<0.05。

2? 結? 果

2.1? 赤星病菌株的采集分離及生物學性狀

由表2看出，從四川攀枝花、涼山、瀘州、宜賓、廣元5個煙區分離出的赤星病菌株表現出鏈格孢屬真菌的典型特征，菌絲在SDAY培養基上生長初期為淡灰白色至灰白色，后期轉變為灰褐色并產生褐色孢子層，在顯微鏡下可見分生孢子具有分隔，并且經過進一步分子鑒定確定為鏈格孢屬真菌。培養5 d后，各煙區所采集的赤星病菌株的菌落直徑（p=0.768 7）、產孢量（p=0.709 7）和萌發率（p=0.851 0）差異均不顯著。

2.2? 赤星病在四川省5個煙區的發生程度

圖1顯示，2017年至2019年6月底至9月初，煙草赤星病在宜賓、攀枝花、涼山、瀘州、廣元5個煙葉產區均有發生，整體發病規律為：煙草赤星病病情指數隨著時間的推移逐漸升高，每年8月，各煙區赤星病病情指數均顯著高于7月并趨于峰值。相同時間，各煙區赤星病病情指數存在差異。由此可以推測赤星病主要為害期為煙草成熟期及成熟后期。5個植煙區2019年煙草赤星病病情指數相對于2017年有所下降，但差異不顯著。2017年至2019年5個植煙區煙草赤星病病情指數分別為：宜賓11.59～10.15，攀枝花12.67～10.59，涼山11.74～8.89，瀘州11.89～9.41，廣元10.04～9.26。

2.3? 赤星病高效防治藥劑篩選

田間試驗結果表明（表3），第1次施藥后7 d，各煙區藥劑處理組的病情指數與對照組相比均有所下降，說明各藥劑對赤星病的發生起到了一定的控制作用，但不同藥劑在不同地區間控制效果不一致。在宜賓和廣元，多數藥劑控制效果顯著，病情指數均與對照達到了顯著差異，而在瀘州、攀枝花和涼山只有1～2種藥劑控制效果明顯。除宜賓的T2和涼山的T3處理外，同一地區不同藥劑之間的防治效果沒有顯著差異。第3次施藥后7 d，隨著赤星病的發展，處理組的防治效果逐漸顯現，各地區5種藥劑處理的病情指數均顯著低于對照，防治效果均高于第1次施藥后。從同一地區不同藥劑的防治效果來看，各地區10%苯醚甲環唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對赤星病的防治效果均優于其他3種藥劑，表現出較為一致的規律。

3? 討? 論

鏈格孢菌具有生長周期短、產孢量大等特點，在田間易引發爆發性流行[5]。在前人研究中，我國部分地區煙草赤星病的病原菌均以鏈格孢屬真菌為主，如唐明等[6]在不同植煙區采集煙草赤星病21個樣品，鑒定結果表明所采集的赤星病病原均為鏈格孢菌;牛俊軻等[7]在黑龍江省和吉林省煙田采集了320個煙草赤星病典型病樣，通過形態學和分子生物學方法確定2個省的煙草赤星病均為鏈格孢菌。本研究從四川5個煙區分離了煙草赤星病病原菌，形態學表現出鏈格孢屬的典型特征，并且經過進一步分子鑒定確定為鏈格孢屬。這與前人研究結果一致。此外，本研究還發現四川5個煙區的赤星病孢子在SDAY培養基上的生長速率、產孢量及萌發率無顯著差異，且都表現出生長速率快和產孢量大等特點，具有在四川各市州引發流行的可能。

赤星病的發生與溫度、濕度等環境因素密切相關。劉學敏等[5]發現越冬赤星病孢子或菌絲在適宜的溫度和高濕環境下可以迅速生長并引發流行病。近年來，有學者研究了赤星病最適生長發育溫度，發現環境溫度在25～31 ℃時易引發赤星病流行[8-9]。本研究在四川5個煙區通過連續3年的調查，發現每年在7月底至8月，當連續陰雨或雨后晴天極易引發田間赤星病爆發，與上述相關研究結果一致。

赤星病主要侵染成熟期煙葉，此時煙葉細胞通透性增加，細胞壁被分解致使抗性減弱[10]，赤星病病原易于侵入;同時，煙葉細胞內可溶性糖含量增多，赤星病病原易于利用營養快速侵染[5]。賀剛等[11]研究了不同煙草品種對赤星病的抗性，發現云煙97表現出抗性，云煙87相對易感，因此種植抗病品種或利用免疫誘抗劑提高煙株自身抗病性是防治赤星病的有效手段。本研究在調查中還發現，煙田赤星病呈逐年下降趨勢，主要原因是隨著煙草病蟲害綠色防控技術的推廣，煙農逐漸接受綠色防控技術理念和產品，在煙葉生產過程中采用壯苗移栽和在苗期使用煙草免疫誘抗劑，提高了煙株自身的抗性。

本研究中，5種供試藥劑在四川不同煙區對煙草赤星病的防治效果不同。總體上看，10%苯醚甲環唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對赤星病有較好的防治效果，且防效穩定。與陳杰等[12]、張彬彬等[13]范敬修等[14]研究結果一致。苯醚甲環唑為三唑類殺菌劑，能夠高效防治多種真菌性病害，同時該藥劑安全、低毒，不污染環境和農副產品[15-16]。但是，也有學者報道苯醚甲環唑和菌核凈在云南、貴州、吉林、黑龍江等地對煙草赤星病菌的防效效果降低[17-20]。為了降低病原抗藥性，提高防治煙草赤星病效果，建議交替使用10%苯醚甲環唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑進行防治。

4? 結? 論

四川攀枝花、涼山、瀘州、宜賓、廣元5個煙區的赤星病病原菌均屬于鏈格孢屬菌（Alternaria spp.），各煙區赤星病病原菌生物學特性差異均不顯著;5個煙區均發生煙草赤星病，整體發病規律為：每年6月底至8月，赤星病病情指數隨著時間的推移逐漸增加;10%苯醚甲環唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對煙草赤星病防治效果最好，且防治效果穩定，可以作為應急藥劑防治煙草赤星病。

參考文獻

[1]JING C L， ZHAO J， HAN X B， et al. Essential oil of Syringa oblata Lindl. as a potential biocontrol agent against tobacco brown spot caused by Alternaria alternata [J]. Crop Protection， 2018， 104： 41-46.

[2]WANG H C， ZHANG C Q. Multi-resistance to thiophanate-methyl， diethofencarb， and procymidone among Alternaria alternata populations from tobacco plants， and the management of tobacco brown spot with azoxystrobin[J]. Phytoparasitica， 2018， 46： 677-687.

[3]李六英，竇彥霞，馬冠華，等. 我國煙草赤星病菌遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 植物保護學報，2018，45（4）：846-855.

LI L Y， DOU Y X， MA G H， et al. Genetic diversity analysis of tobacco brown spot pathogens in China by ISSR[J]. Journal of Plant Protection， 2018， 45（4）： 846-855.

[4]CHENG D D， JIA Y J， GAO H Y， et al. Characterization of the programmed cell death induced by metabolic products of Alternaria alternata in tobacco BY-2 cells[J]. Physiologia Plantarum， 2011， 141： 117-129.

[5]劉學敏，常穩，李大壯. 煙草赤星病研究現狀及存在問題[J]. 東北農業大學學報，2000，31（1）：80-85.

LIU X M， CHANG W， LI D Z. Researching advance of tobacco brown spot caused by Alternaria alternata[J]. Journal of Northeast

Agricultural University， 2000， 31（1）： 80-85.

[6]唐明，向金友，謝冰，等. 宜賓烤煙赤星病致病力分化、生物學特性及抑菌藥劑篩選研究[J]. 天津農業科學，2016，22（10）：96-101.

TANG M， XIANG J Y， XIE B， et al. Study on pathogenicity differentiation， biological characteristics of Alternaria alternata and screening of the effective fungicides in Yibin[J]. Tianjin Agricultural Sciences， 2016， 22（10）： 96-101.

[7]牛俊軻，盧寶慧，劉麗萍，等. 吉林省和黑龍江省煙草赤星病病原鑒定[J]. 中國煙草科學，2019，40（5）：52-59.

NIU J K， LU B H， LIU L P， et al. Identification of the pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 52-59.

[8]STAVELY J R， MAIN C E. Influence of temperature and other factors on initiation of tobacco brown sopt[J]. Phytopathology， 1970（60）： 1591-1596.

[9]郭永峰. 赤星病抗源的抗性比較[J]. 中國煙草科學，1997（1）：1-6.

GUO Y F， ZHU X C， KONG F Y， et al. Comparison of resistance in various brown spot resistant varieties[J]. Chinese Tobacco Science， 1997（1）： 1-6.

[10]康子騰，蔣黎明，羅義勇，等. 植物病原鏈格孢屬真菌的致病機制研究進展[J]. 生命科學，2013，25（9）：908-914.

KANG Z T， JIANG L M， LUO Y Y， et al. The research advances of mechanism of pathogenicity of Alternaria phytopathogenic fungi[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences， 2013， 25（9）： 908-914.

[11]賀剛，廖衡斌，李文宇，等. 煙草品種和打頂時期對煙草赤星病發病情況的影響[J]. 農學學報，2017（12）：65-69.