與稻瘟病抗性基因Pigm緊密連鎖的分子標記的設計和應用

朱先飛 張志清 李婧婧

摘 要：利用已克隆的Pigm基因的核酸序列在基因功能區設計新引物，鑒定到不育系材料FD1712的功能區序列差異，開發了基于PCR的新的插入/缺失（insert-deletion， InDel）標記，標記與基因功能緊密連鎖。通過擴增和電泳檢測，表明引物擴增穩定;通過稻瘟病菌的接種鑒定，表明新開發的標記能有效鑒別稻瘟病抗性，可用于分子標記輔助育種。

關鍵詞：水稻;稻瘟病;抗性基因;分子標記輔助育種

中圖分類號 S435.111.4+1;S503.53文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）04-0020-04

Abstract： Using the nucleic acid sequence of the cloned Pigm， new primers were designed in the gene functional region to identify the difference of functional region sequence of sterile line FD1712， and a new insert deletion （indel） marker based on PCR was developed， which was closely linked with gene function. The results of amplification and electrophoresis showed that the primer amplification had stable polymorphism. The results of inoculation and identification of Magnaporthe grisea showed that the newly developed markers could effectively identify blast resistance and could be used in molecular marker assisted breeding.

Key words： Rice; Rice blast; Resistance gene; Molecular marker assisted selection breeding

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約50%的人口都以稻米為主食[1]。稻瘟病是由子囊菌（Magnaporthe oryzae）引發的水稻真菌性病害，是一種世界性的水稻病害，嚴重威脅著水稻的高產、穩產[2]。我國稻瘟病的年發生面積均在380萬hm2以上，由稻瘟病導致的水稻減產量占總產的10%～30%[3]。實踐表明，解決稻瘟病危害最有效、最經濟環保的策略是發掘和利用廣譜持久抗性基因，選育和推廣抗病品種[4，5]。分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）育種技術具有可靠、高效、安全等優點，在植物分子育種實踐中，尤其是作物個別性狀改良中應用越來越廣泛[6]。

利用與基因連鎖（或基因內）標記，在育種過程中對目標單株進行標記基因型鑒定和選擇，尤其是共顯性分子標記還能有效鑒定純合基因型，可大大提高育種效率，縮短育種周期，常用于連續回交育種定向改良受體目標性狀，是現代分子育種的重要手段[7，8]。顯性廣譜持久抗瘟基因Pigm來源于四川地方水稻品種谷梅4號，已被克隆[9]，被廣泛證明是非常有效的稻瘟病抗性基因，利用其育成和改良了多個水稻品種[10-12]。

1 材料與方法

1.1 水稻材料 攜帶抗性基因Pigm的谷梅4號是四川省農業科學院植物保護研究所選育的常規秈稻，FD1712是安徽豐大種業選育的優良不育系，但是在稻瘟病高感地區表現感病。本研究以谷梅4號和FD1712分別為供體和受體材料，以及谷梅4號×FD1712的F1、F2為測試材料。

1.2 DNA提取 采用堿煮法提取[13]，切取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40mL的0.2mol/L氫氧化鈉水溶液，在100℃條件下水浴3min，再加入60mL的0.17mol/L tris-HCL，在100℃條件下水浴1min，取出后置于4℃冰箱備用。

1.3 PCR擴增 含Mg2+的10x Buffer 2μL，10mmol的dNTP 0.4μL，5μmol的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和5μmol的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列各2μL，從待測水稻中提取的基因組DNA 1μL，5U/μL的taq酶0.5μL，其余為超純水，反應體積為20μL，滴加1滴礦物油覆蓋;PCR擴增反應程序為：94℃、5min，94℃、60s，53.5℃、60s，72℃、60s，35個循環;72℃、10min。

1.4 聚丙烯酰胺電泳、銀染和記錄 用6%的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測PCR產物，主要包括3步：（1）制膠：稱取9.6g尿素，加45mL蒸餾水和8mL 10×TBE，攪拌溶解，加入12mL 40%丙烯酰胺溶液，混勻后加入0.8mL 10%過硫酸胺和35?L TEMED，攪拌均勻后立即注入已用瓊脂糖凝膠封口的玻璃板中，注滿后傾斜放置。插入梳子，靜置，使膠凝固;（2）點樣：待膠完全凝固后，小心拔出梳子，盡量保持點樣孔完整。將玻璃板固定垂直電泳槽上，加入適量的1×TBE電泳緩沖液;取PCR擴增產物，每管PCR產物中加入4?L上樣緩沖液（0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯氰、50%甘油），混勻后用微量進樣器吸5?L注入點樣孔;（3）電泳：調電壓至200V，電泳時間3～4h。

電泳完畢后，將玻璃板從電泳槽上拆下，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗2次;轉移至0.1% AgNO3溶液中染色，在搖床上輕搖約10min;然后將凝膠轉移至蒸餾水中漂洗2次;最后轉入顯色液（6g氫氧化鈉、0.076g四硼酸鈉、1.6mL甲醛，加水定容至400mL）中顯色約10min，著色后用水漂洗2次，終止顯色反應并去除附著的顯色液。用凝膠成像系統記錄結果。

1.5 引物設計

1.5.1 雙親基因組擴增和測序 采用堿煮法提取谷梅4和FD1712葉片的基因組DNA，以Yiwen Deng[9]公布的序列設計引物，由核苷酸序列5′-gccgatgccgattctagccg-3，和核苷酸序列5，-gagttcaaggaggatacgac-3，組成，委托北京梓熙生物公司合成后進行PCR擴增。PCR擴增產物送北京梓熙生物公司進行測序。

1.5.2 引物設計 測序結果在NCBI網站進行在線比對，結果見圖1。圖中虛線區域表示20bp的缺失，其中query代表父本谷梅4，高抗稻瘟病的序列;sbjct代表母本FD1712，不抗稻瘟病的序列，說明FD1712在此區域少了20bp堿基。根據圖1的測序比對結果，利用在線引物設計軟件Primer3.0設計引物，在跨越2個序列有20bp插入缺失差異區域設計引物。設計完成的新引物命名為Pigm-1712，上游引物核苷酸序列為5′-ggacctaaccgatgcaacac-3′，下游引物核苷酸序列為5′-ttgttcaaggctgcattgct-3′。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物均位于基因Pigm內部功能區域。

1.6 稻瘟病病菌接種與調查 種子浸種催芽后分別播種于32孔塑料墊板中，育苗基質為盆栽花卉培養基，幼苗在26～28℃的人工氣候室內12h光照、12h黑暗培養至3～4葉期。采用混合生理小種約1×105/mL濃度的稻瘟菌孢子懸浮液活體噴霧接種，于26℃黑暗保濕24h后，繼續保持光照高濕5～7d，參照Bonman[14]的0～5級標準調查病情（0～2級為抗病，3～5級為感病）。接種結果見圖2，左邊為感病材料，發病明顯;右邊為抗病材料，表現抗病。

2 結果與分析

2.1 引物效果驗證 利用新合成的引物擴增谷梅4和FD1712，以及兩者的雜交種F1。PCR擴增產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并觀察拍照，如圖3所示。FD1712、谷梅4和雜交種各2個重復，Marker大小為250bp。對PCR擴增產物進行測序，從擴增產物的電泳圖可以清晰看出，谷梅4只有1條電泳帶，經測序所述電泳帶對應的擴增產物為272bp堿基片段;FD1712只有1條電泳帶，經測序所述電泳帶對應的擴增產物為252bp堿基片段;雜交品種有2條電泳帶，經測序所述電泳帶對應的擴增產物為272bp和252bp堿基片段（圖3）。由此可見，新設計的引物擴增效果好，電泳帶型清晰無雜帶，引物可用于2種基因型的鑒別。

2.2 擴增產物與水稻稻瘟病抗性性狀的相關性 以高抗稻瘟病材料谷梅4和不抗稻瘟病材料FD1712作親本，兩者雜交后自交的432個F2 代材料為試驗對象。PCR擴增產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，銀染法染色并觀察拍照記錄，其中純合272bp的105株，純合252bp的97株，雜合帶型的220株，同時對這432株材料進行接種鑒定。由表1可知，供試水稻樣本中存在純合272bp的105株，其中102株表現為抗病，3株感病;而不帶有272bp片段的97個材料中92株感病，5株抗病;雜合的220株中，216株表現為抗病，4株感病;兩者的一致性達到97.1%。由此可見，新設計的引物Pigm-1712是與稻瘟病抗性性狀相關位點緊密連鎖的分子標記，完全可用于水稻分子標記輔助育種。

3 結論與討論

分子標記輔助選擇育種以其準確、快速且不受環境影響等優點，已被廣泛應用于作物育種實踐中[15-17]，在水稻稻瘟病抗性分子育種方面已成功選育出多個優良抗病新品系或新材料[18-20]。水稻稻瘟病抗性是典型的質量數量性狀，易受環境影響，常規育種中的表型選擇往往不準確，育種效率低。分子標記輔助育種是通過標記基因型分析和選擇代替表型選擇，可大大提高選擇準確性和育種效率[21]。Pigm是一個廣譜抗稻瘟病基因，比公認的廣譜抗性基因Pi1、Pi2、Pi3的抗譜更廣。Pigm的供體谷梅4號對收集自不同地區和國家的30個強致病菌株中的29個表現高抗或免疫[22]。何祖華團隊自2002年開始廣泛篩選抗瘟種質，從起源于我國農家品種的育種材料中鑒定了1個廣譜抗瘟性新位點Pigm。利用Pigm選育的品種就既有廣譜抗病性又不影響最終的產量[9]。

本研究中設計的分子標記位于抗性基因Pigm的基因內部，與水稻稻瘟病抗性基因Pigm緊密連鎖。與非基因內部標記相比，新設計的InDel分子標記不會與基因功能出現分離，可以更有效地提高育種效率。本研究中設計的分子標記可以很好地擴增經過簡單處理所得到的從待測水稻中提取的基因組，克服了現有技術中與該基因緊密連鎖的其他分子標記需要依靠CTAB等較為繁瑣的方法提取基因組的問題，更加簡便實用，進一步提高了育種效率。本研究篩選獲得的分子標記在 F1群體中的抗瘟表型選擇效率達97.1%。由于稻瘟病菌具有多樣性和快速變異性，導致抗病水稻品種在不同環境條件下表現出抗瘟性的不穩定[23]。實踐證明，將多個抗菌譜不同的抗瘟基因聚合到同一個水稻品種中，是培育廣譜持久抗瘟品種的有效策略[24]。本研究中選用的抗病親本谷梅4號雖然抗瘟性較強，抗菌譜較廣，但也存在極少數基因與接種抗性不一致的情況，推斷其原因是由于生理小種不同引起，因此今后可嘗試加強Pigm基因與其他廣譜抗瘟基因（如Pi9、Pi2等）的分子聚合育種工作。

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（責編：徐世紅）