稻瘟病生防細菌的篩選及其防效測定

孫正祥，鄭通文，毛國慶，劉璐，陳東，周燚

1.長江大學農學院，湖北 荊州 434025 2.湖北省農林病蟲害預警與調控工程技術研究中心(長江大學)，湖北 荊州 434025

水稻是世界上第三大糧食作物，僅次于小麥和玉米，養活了世界上超過50%的人口，其食用價值至關重要[1]。由稻梨孢(Magnaporthegrisea)侵染引起的稻瘟病是世界范圍內危害水稻最嚴重的病害之一，已蔓延至80多個國家，平均每年造成的產量損失可達30%[2]。該病害易突發、流行快，防治難度大。目前,用于防治稻瘟病的措施主要包括農業防治、抗病育種和化學防治，農業防治雖有效但費時費力；抗病育種難度大、周期長，且品種抗性易喪失；化學防治會導致病原菌產生抗藥性，且造成環境污染，危害人體健康[3]。生物防治安全有效且可持續，具有良好的發展潛力。

目前報道的稻瘟病生防菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)和假單胞桿菌屬(Pseudomonasspp.)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[4]、堅強芽孢桿菌(B.firmus)[5]、甲基營養型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)[6]和熒光假單胞菌(P.fluorescens)[7]，這些菌株具有良好的室內防效，但其田間防效不理想，且難以直接應用。因此，篩選更多更優質的稻瘟病生防細菌意義重大。研究從對節白蠟(FraxinushupehensisChiu，ShangetSu)及其根際分離篩選對稻瘟病菌(M.grisea)具有較強拮抗作用的細菌，測定其離體葉片防效、盆栽防效和產胞外酶活性，以期為稻瘟病的生物防治提供更多的菌源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試稻瘟病菌由長江大學植物與微生物互作研究室分離與保存；供試水稻品種為麗江新團黑谷(感病品種)；供試培養基有PDA培養基、NB培養基[8]、燕麥片培養基[9]、羧甲基纖維素鈉培養基[10]、脫脂牛奶培養基[10]、鉻天青培養基[10]和幾丁質酶檢測培養基[10]。供試對照藥劑為枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，由河北省保定市科綠豐生化科技有限公司生產。

1.2 稻瘟病菌拮抗細菌的分離純化

于長江大學農學院植物園內選取2株長勢良好的對節白蠟，挖取適量根部組織，并收集根際土，將根組織和根際土分別裝在采樣袋中帶回實驗室備用。根際細菌的分離：取10g根際土，加入90mL無菌水振蕩懸浮，隨后進行梯度稀釋，取適量的10-6、10-7、10-8稀釋液分別涂布于NA平板[11]。對節白蠟內生菌分離：稱量1g的根組織，表面消毒后，于無菌研缽中充分研磨，將研磨液梯度稀釋，取適量的10-4、10-5、10-6稀釋液分別涂布于NA平板。將上述的NA平板置于28°C培養箱中，2d后挑取顏色、光澤、邊緣光滑度和厚度不同的單菌落于新的NA平板上進行劃線培養，所得菌株斜面保存備用。

1.3 稻瘟病菌拮抗細菌的篩選

初篩：采用平板對峙法[12]篩選稻瘟病菌的拮抗細菌，28°C培養5d，記錄具有抑菌活性的菌株編號。

復篩：參照王宇婷等[13]的平板打孔法檢測初篩所得菌株對稻瘟病菌的抑制作用，不同之處是利用無菌打孔器在距離平板中央2cm處三點對稱打孔，每孔注入20μL供試菌株的菌液。待對照平板中病原菌菌絲即將長滿全皿時，測量各處理的病原菌菌落半徑，并計算其抑菌率[14]。

1.4 稻瘟病菌拮抗細菌的離體葉片篩選

選擇長勢一致的水稻植株(4～5葉期)采集葉片，用無菌剪刀剪成5cm長的片段，經次氯酸鈉消毒后平均分為4組，分別進行如下處理：待測細菌發酵液+稻瘟病菌、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑+稻瘟病菌、NB培養液+稻瘟病菌、待測細菌發酵液。

將待測菌株接種至NB培養基中，28°C、130r/min培養48h，利用分光光度計將發酵液濃度調至光密度D600nm為1.0，備用。稻瘟孢子懸浮液的制備：將活化的稻瘟病菌接種至燕麥培養基上，28°C培養7d后每皿加入5mL無菌水洗脫分生孢子獲得懸浮液，并用血球計數板將分生孢子的濃度調至1.0×106cfu/mL，向懸浮液中加入0.1%吐溫20[15]，備用。

將葉片浸泡于待測菌株發酵液中，處理30min后置于鋪有2層濕潤濾紙的培養皿中，用無菌牙簽輕刺葉片表面，每段葉片刺傷3個點，在每個點上滴加稻瘟病菌孢子懸浮液5μL，然后將培養皿封口置于溫室(25°C，光照時間∶黑暗時間=16h∶8h)中。以浸泡于枯草芽孢桿菌菌劑溶液為陽性對照，以浸泡于NB為陰性對照，每個處理3次重復，含水稻葉段18個。3d后參照沙月霞等[16]的方法調查各處理稻瘟病的病情嚴重度，并計算相應的病情指數和防效。

1.5 拮抗細菌對稻瘟病的盆栽防效測定

挑選健康、飽滿的水稻種子浸泡24h，置于28°C培養箱中保濕催芽，露白后播種于裝有無菌泥土的塑料盆中，21d后移栽于塑料桶中，每桶栽種7株。試驗分為3個處理：拮抗細菌懸浮液+稻瘟病菌、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑+稻瘟病菌、NB培養液+稻瘟病菌。

拮抗細菌懸浮液和稻瘟病菌孢子懸浮液的制備參照1.4，每處理含有0.02%吐溫80表面活性劑[17]。選取分蘗末期長勢一致的水稻，噴施拮抗細菌懸浮液，至葉片向下滴水為止，24h后噴施病原菌孢子懸浮液。以噴施NB培養液為對照，每7d噴施1次，連續噴施2次，每處理4次重復。第二次噴施藥劑后7d參照沙月霞等[18]的方法調查各處理葉瘟的病情嚴重度，并計算相應的病情指數和防效。

1.6 稻瘟病菌拮抗細菌產胞外酶活性測定

選擇對稻瘟病防效較好的菌株，檢測其產胞外酶活性。拮抗菌株產蛋白酶、纖維素酶、幾丁質酶和嗜鐵素的活性測定均參照陳思宇等[10]的方法進行，分別測定相應的透明圈或暈圈大小并計算平均值，實驗重復3次。

1.7 稻瘟病菌拮抗細菌的鑒定

選擇拮抗作用較強的菌株進行分子生物學鑒定。使用OMEGA細菌基因組提取試劑盒提取拮抗細菌的DNA，采用16S rDNA基因通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′)進行PCR擴增[19]。取少量PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物送至擎科新業生物技術有限公司測序。將所得序列分別在NCBI核酸數據庫采用BLAST程序進行同源性搜索比對，通過MEGA 7.0軟件構建系統發育進化樹。

1.8 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，檢驗組間差異顯著性，數據表示為平均數±標準差。

2 結果與分析

表1 稻瘟病菌拮抗細菌的來源和相對抑菌率

圖1 菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition effects of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 on M. grisea

2.1 稻瘟病菌拮抗細菌的分離和篩選

從對節白蠟及其根際共分離獲得193株細菌，通過篩選得到7株對稻瘟病菌有抑制作用的菌株，其中根際細菌YZU-S033和YZU-S061的拮抗能力較強，抑菌率分別為75.47%和73.30%(見表1、圖1)。

2.2 稻瘟病菌拮抗細菌的離體葉片篩選

篩選出的7個菌株在離體葉片試驗中均能減輕稻瘟病的發病程度，其中菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病的防效最好。對照水稻葉片的病情指數為60.5，而經菌株YZU-S033和YZU-S061處理的水稻葉片病情指數分別為11.1和18.5，其防效分別為81.7%和69.4%，明顯優于枯草芽孢桿菌菌劑的防效(61.5%)(見表2、圖2)。選擇菌株YZU-S033和YZU-S061進行后續實驗。

(a)稻瘟病菌+NB；(b)稻瘟病菌+枯草芽孢桿菌可濕性粉劑； (c)稻瘟病菌+YZU-S033；(d)稻瘟病菌+YZU-S061； (e)YZU-S033；(f)YZU-S061。 圖中紅色箭頭標注的是稻瘟病病斑。 圖2 菌株YZU-S033和YZU-S061對稻瘟病的離體葉片防效Fig.2 Control effects of YZU-S033 and YZU-S061 on rice blast in detached leaf assay

表2 不同菌株對稻瘟病的離體相對防效

2.3 拮抗細菌對稻瘟病的盆栽防效測定

盆栽試驗結果顯示，對照組水稻的病情指數為24.2，經菌株YZU-S033和YZU-S061處理后的水稻病情指數分別為7.3和8.7。2個菌株對稻瘟病的防效分別為69.8%和64.0%，與對照藥劑防效相當(見表3)。

2.4 拮抗細菌產胞外酶活性測定

菌株YZU-S033和YZU-S061均能產生蛋白酶和纖維素酶，其降解圈的直徑均大于10mm，但二者均不產生幾丁質酶(見表4、圖3)。此外，菌株YZU-S061還能分泌嗜鐵素。

表3 2株拮抗菌株對稻瘟病的盆栽相對防效

表4 菌株YZU-S033和YZU-S061產胞外酶活性測定結果

圖3 菌株YZU-S033和YZU-S061產胞外酶活性Fig.3 Extracellular enzyme activity of strain YZU-S033 and strain YZU-S061

2.5 菌株YZU-S033和YZU-S061的鑒定

BLAST結果顯示，菌株YZU-S033和YZU-S061的序列均與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)Y9的序列具有99%的相似度。系統發育樹顯示，2個菌株都和貝萊斯芽孢桿菌在同一分支上(見圖4)，初步鑒定菌株YZU-S033和YZU-S061均為貝萊斯芽孢桿菌。

圖4 基于菌株YZU-S033和YZU-S061的16S rDNA序列及其相似序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on the 16S rDNA sequences of strain YZU-S033 and strain YZU-S061 and their homologous sequences

3 討論與結論

目前國內外已有不少關于篩選和利用拮抗細菌防治稻瘟病的報道[8，20，21]，但這些菌株大多來源較為單一，難以發揮穩定的生防作用。對節白蠟是我國特有的一種藥用植物，其生長過程中鮮有病蟲害發生，有研究表明這可能與其自身產生的活性物質有關[22]，而這些物質可能來自其內生細菌或根際細菌。研究從對節白蠟及其根際分離篩選稻瘟病菌的拮抗菌，獲得拮抗效果較好的細菌2株，其抑菌率均在70%以上，經鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

沙月霞等[23]分離得到的貝萊斯芽孢桿菌E69對稻瘟病菌具有良好的平板抑制效果，其盆栽防效可達83.24%。筆者研究結果與之相似。菌株YZU-S033和YZU-S061在離體葉片試驗中對稻瘟病的防效分別為81.7%和69.4%，對稻瘟病的盆栽防效為69.8%和64.0%。與離體葉片防效相比，盆栽防效略微偏低，可能原因是接種病菌后水稻培養時間偏短，導致稻瘟病發病程度較輕。

拮抗細菌分泌的多種胞外酶均可破壞植物病原真菌菌絲的細胞壁，使病原菌無法完成菌絲生長、孢子萌發等代謝過程，從而達到預防植物病害的目的[24]。此外，拮抗細菌可通過產生和利用嗜鐵素，與環境中的病原微生物競爭鐵離子，使其因缺乏鐵元素而無法正常生長和繁殖，從而控制植物病害的發生[25]。研究中，菌株YZU-S033和YZU-S061產生蛋白酶和纖維素酶的能力較強，其中菌株YZU-S061還可分泌嗜鐵素，說明產生胞外酶和嗜鐵素是其生防作用機制之一。

研究還篩選得到了2株對稻瘟病具有良好防效的菌株，并對其機制進行了初步研究。然而，這2株拮抗細菌對稻瘟病的田間防效還有待進一步研究。此外，后續研究還將探討其定殖性和抑菌活性物質的產生等特性，為拮抗菌株的開發應用提供更多的實踐基礎。