基于金粒子修飾二硫化鉬納米復合材料的電化學發光免疫傳感器的構建及其應用研究

孫瑩瑩，吳曉惠

(遼寧中醫藥大學 醫學檢驗學院，遼寧 沈陽 110847)

前列腺癌作為一種嚴重的泌尿系統癌癥之一，是最常見的男性惡性腫瘤，對男性的健康狀況危害極大。自從1980年Papsidero課題組[1]首次闡明了前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)與前列腺癌的相關性，PSA就作為檢測前列腺病癥的最佳標記物，長期用于男性前列腺癌的早期診斷。目前臨床上常用于PSA檢測的方法有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、色譜法和放射性免疫分析(RIA)法等[2-3]。然而，這些方法不僅操作復雜，還存在輻射傷害和環境污染等問題。因此，構建一種快速、靈敏、準確且無污染的分析方法用于檢測病人體內的PSA成為人們努力的方向。

電化學發光(Electrochemiluminescence，ECL)是化學發光與電化學相結合的產物[4-6]。這種分析方法具有背景信號低、靈敏度高、自動化程度高、無污染等優點，被廣泛應用于生物分析、醫藥檢測、環境和食品檢測等領域[7-9]。電化學發光免疫分析是將電化學發光檢測和免疫分析相結合的免疫標記分析技術，通過利用電化學發光試劑來標記抗原或抗體后，進行相應的免疫反應和理化步驟，記錄反應前后電化學發光信號的差值，并對待測物的濃度進行分析。這種方法不僅具有免疫分析技術的高特異性，而且具有電化學發光技術的高靈敏度、低背景、無輻射污染等特點，被廣泛用于檢測與各種疾病相關的蛋白質及核酸[10-11]。然而，在實際臨床檢測中，目標待測物的濃度往往很低，甚至達到痕量級別，為了提高傳感器的靈敏度，引入信號放大技術是實現痕量物質定量檢測的重要手段[12]。

信號放大技術是一種增強信號強度的技術。對于電化學發光檢測，一般從兩個方面實現信號放大：①單位空間內增加信號標簽的數量；②在電化學發光過程中提高單個信號標簽的發光效率。納米材料因其具有較大的比表面積、良好的電子傳遞能力以及優秀的生物相容性，常作為一種信號放大的手段用于提高傳感器的靈敏度。如韓靜等[13]利用QDs-PAMAM-Pd/Au 納米材料作為生物探針，以GNRs/GO 作為基底構建了電化學發光免疫傳感器檢測蘇丹紅I號。因GNRs/GO具有超大的比表面積，可增加包被抗原的負載量，從而有效地放大ECL信號；Wang等[14]制備了一種基于魯米諾發光體系的非標記型電化學發光生物傳感器檢測大腸桿菌。利用AgBr負載的N摻雜的3D石墨烯對魯米諾發光體系進行催化，增加了魯米諾發光效率，最后達到信號放大效果。該方法對大腸桿菌的檢測范圍為0.5～500 cfu/mL，檢出限為0.17 cfu/mL。

二硫化鉬(MoS2)是一種性能優異的過渡金屬二硫化物，由于其具有較大的比表面積、較高的催化活性和良好的光學性能，在能量轉換、儲存、催化、傳感等領域得到了廣泛的應用[15-17]。然而，MoS2作為一種典型的半導體，其導電能力不夠理想，且水溶性較差，因此MoS2的改性和功能化對其在電化學領域的應用十分重要。已有文獻表明，將碳納米材料摻雜在MoS2結構中，可有效提高復合材料的導電能力和水溶性。因此，本課題組利用石墨烯和碳納米管作為支撐骨架，采用水熱法制備出具有三維花狀結構的MoS2/GO/o-MWNTs 納米復合材料，并采用原位還原法將金納米粒子修飾在其花瓣狀結構上。所得Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合材料(AMGMs)不僅克服了單一MoS2導電性差、易聚集的缺點，其生物相容性也有所提高[18]。

本文利用已合成的AMGMs 納米復合材料作為固定化基底，結合“三明治”免疫夾心組裝法構筑高靈敏的電化學發光免疫傳感器，實現了血清中PSA的高靈敏檢測。首先，以三維花狀的AMGMs作為傳感基底可提高抗體的負載量。其次，該納米復合膜優良的導電性和生物相容性能夠加速反應中電子傳遞的速率，同時最大程度地保持抗體活性，從而提高檢測效率，實現信號放大。在優化實驗條件下,電化學發光免疫傳感器的ECL響應與PSA濃度的對數值呈正比,線性范圍為0.1 pg/mL～50 ng/mL,檢出限(S/N=3)為0.1 pg/mL。將該傳感器應用于人血清樣品中PSA的檢測，所得抗原的加標回收率為98.2%～106%,說明該方法的準確性良好，具有極好的臨床應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

場發射掃描電子顯微鏡(FESEM)圖像在SHIMADZU SSX-550上測定。透射電子顯微鏡(TEM)圖像在Hitachi H-7650上測定。電化學發光實驗在MPI-E型電化學發光檢測儀(西安瑞邁)上進行，光電倍增管高壓為800 V，放大級數為3。電化學實驗在CHI 660B電化學工作站(上海辰華)上進行。三電極系統：以修飾的玻碳電極(3 mm直徑)為工作電極 ，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。采用循環伏安法和電化學交流阻抗法研究傳感器的組裝過程，采用電化學發光法定量研究該傳感器對PSA的響應信號。循環伏安實驗在含1 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的PBS溶液中進行。電化學交流阻抗實驗以5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)為探針，在電位Eo=0.17 V下進行，頻率范圍為0.1～100 000 Hz，交流電壓振幅為10 mV。

Anti-PSA Ab1(PSA抗體1)、生物素修飾的Anti-PSA Ab2-B(PSA抗體2)、PSA抗原、牛血清蛋白(BSA)購于上海生工生物工程公司；鏈霉親和素(SA)和三丙胺(TPrA)購于美國Sigma公司；三聯吡啶釕復合物(Ru complex，蘇州Suna科技有限公司)；多壁碳納米管(MWNTs，純度大于95%,深圳納米港有限公司)，氧化石墨烯(GO，南京吉倉納米科技有限公司)，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、硫脲、氯金酸( HAuCl4)購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用的人體血清由沈陽醫學院附屬中心醫院提供。所有試劑均為分析純且使用時未進一步純化。實驗用水為高純水(電阻系數≥18.2 MΩ·cm,Milli-Q,美國Millipore公司)，所用PBS緩沖液均為pH 7.4,濃度為0.1 mol/L。

1.2 Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合材料的制備

Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合材料(AMGMs)的合成參照本課題組之前的工作[18]。首先，將MWNTs進行酸化處理，得到氧化多壁碳納米管(o-MWNTs)。將一定量的o-MWNTs和氧化石墨烯(GO)超聲溶解于水中，隨后加入鉬酸鈉和硫脲的混合溶液，攪拌1 h。將該溶液轉移至水熱合成反應釜中，并在210 ℃的電烘箱中放置24 h，取出自然冷卻至室溫，進行離心洗滌、凍干備用。為使金納米粒子修飾在MoS2/GO/o-MWNTs表面，稱取一定量MoS2/GO/o-MWNTs，超聲溶解于水中后，快速加入0.5 mmol/L HAuCl4溶液，震蕩混勻，靜置30 min后得到Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合物。

1.3 Ru complex修飾鏈霉親和素(SA-Ru)的制備

SA-Ru的合成制備參照Deiss[19]的方法稍作修改：首先，將1 mg鏈霉親和素(SA)溶解在1 mL水中，取該溶液100 μL加入810 μL水和90 μL PBS(pH 7.4)混合均勻，隨后加入Ru complex的DMSO溶液100 μL(質量濃度為1 g/mL)，4 ℃下連續攪拌4 h。最后，將混合物轉移至透析袋中(截流分子量為10 000，透析液為PBS)透析16 h，每隔3 h換透析液。透析結束后，取出溶液，放入4 ℃冰箱中保存備用。

1.4 電化學發光免疫傳感器的組裝

電化學發光免疫傳感器的組裝過程如圖1所示。在預先處理干凈的玻碳電極(GCE)表面滴涂10.0 μL AMGMs納米復合物，室溫自然干燥，使其形成一層均勻致密的薄膜。隨后將10 μL Ab1(12.0 μg/mL)滴加至電極表面，冰箱內孵育過夜后，用PBS洗滌，并用BSA封閉液孵育1 h。37 ℃下，將不同濃度的PSA底液滴至上述修飾電極表面，恒溫孵育1 h以捕獲大量PSA。再次洗滌后，將10 μL Ab2-B(10.0 μg/mL)滴至上述電極表面，37 ℃下孵育1 h，以結合形成夾心結構。最后，在上述電極表面滴加SA-Ru 溶液，37 ℃孵育30 min，利用生物素與親和素之間的特異性親和作用，將SA-Ru組裝至電極表面。采用循環伏安法和電化學交流阻抗法研究傳感器的組裝過程，采用電化學發光法檢測不同PSA濃度下傳感器的發光信號，從而實現PSA的定量檢測。

圖1 用于檢測 PSA的電化學發光免疫傳感器構建示意圖

2 結果與討論

2.1 電化學發光免疫傳感器的制備與表征

采用FESEM和TEM對合成的三維花狀Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合材料(AMGMs)的形貌進行了表征(圖2A、2B)。可觀察到AMGMs呈現三維花瓣狀的球型結構，粒徑范圍為0.8～1.0 μm,在其花瓣上均勻分布有粒徑約為5～10 nm的金納米粒子。上述實驗現象均表明AMGMs納米復合材料已成功制備。隨后，將AMGMs作為納米基底固載Ab1，利用三明治免疫反應將修飾生物素的二抗(Ab2-B)組裝至電極表面，最后利用生物素與親和素之間的特異性作用，將修飾Ru complex的親和素(SA-Ru)固定在電極表面。

采用電化學循環伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)對上述電化學發光免疫傳感器的組裝過程進行跟蹤表征。如圖2 C所示，裸GCE(曲線a)的CV曲線呈現出一對可逆的氧化還原峰，其峰電位差為0.08 V，是單純的Fe2+/Fe3+在電極上轉移電子所產生；當在其表面修飾AMGMs納米復合材料后(曲線 b)，這對氧化還原峰電流減弱，峰電位差增加，這是因為AMGMs在電極表面形成了一層光滑致密的薄膜，致使電極界面處的電子轉移受到阻礙。當進一步向電極表面修飾Ab1、BSA、PSA、Ab2-B、SA-Ru后，電極的氧化還原峰電流強度逐漸下降，峰電位差逐漸增加，直至氧化還原峰消失(曲線 c、d、e、f、g)，這是由于Ab1、BSA、PSA、Ab2-B和SA-Ru等均為非導電的蛋白質大分子，這種蛋白的封閉作用導致電極界面電子傳遞被阻礙。實驗表明傳感器已成功組裝。

圖2 AMGMs的FESEM(A)及TEM(B)圖，電化學發光免疫傳感器組裝過程的CV(C)及EIS(D)圖

電化學交流阻抗譜(EIS)也常被用作表征電極界面情況的手段之一[20]，其圖譜中的高頻區半圓直徑值為電極表面電荷轉移電阻的大小，常用Ret表示。圖2D為傳感器在不同組裝過程中的電化學阻抗譜圖。對于無任何修飾的GCE，圖譜顯示出近似直線的圖形(曲線a)，說明電極表面幾乎無阻礙電子傳遞的物質。當AMGMs在電極表面形成薄膜時,EIS半圓增加，Ret增大，說明納米復合材料所形成的薄膜阻礙了電子在電極表面的轉移(曲線b)。當Ab1 和BSA 組裝至電極后，由于蛋白的加入導致電阻逐步增大(曲線c、d)，而當PSA被Ab1所捕獲和加入Ab2-B形成三明治結構后，電阻進一步增大(曲線e、f)；最后引入SA-Ru，使阻抗再次增大(曲線g)。綜合CV和EIS的檢測結果，可看出每一步電極的修飾過程均是有效的，各物質均成功地修飾到了電極表面。

圖3 SA-Ru/Ab2-B/BSA/Ab1/AMGMs/GCE(a),SA-Ru/Ab2-B/PSA/BSA/Ab1/AMGMs/GCE(b)及SA-Ru/Ab2-B/PSA/BSA/Ab1/GCE(c)在含有10 mmol/L TPrA 的PBS溶液中的ECL圖

2.2 電化學發光免疫傳感器的可行性分析

為了驗證設計的電化學發光免疫傳感器用于PSA檢測的可行性，采用電化學發光法在PBS緩沖液中對傳感器進行測定，結果如圖3所示。當組裝過程中未滴加PSA時，傳感器未檢出任何發光信號(曲線a)，這是由于缺乏PSA時，三明治結構無法構建，從而導致Ab2-B和SA-Ru無法組裝到電極表面，因此未檢出Ru的發光信號。當組裝過程中滴加了50 ng/mL PSA后，傳感器檢測到很強的ECL信號，且發光強度達4 483 a.u.(曲線c)，這說明在PSA存在下，SA-Ru被成功地組裝到電極表面，并產生強而穩定的電化學發光信號，充分證明通過檢測電極上Ru的發光強度來確定PSA濃度是可行的。

為了證實AMGMs納米復合材料在電化學發光免疫體系中的信號放大作用，本文進行了對比實驗，結果如圖3b所示。當將Ab1、BSA、PSA、Ab2-B和SA-Ru直接組裝到裸玻碳電極上后，雖然可檢出電化學發光信號，但信號非常弱，發光強度僅為1 280 a.u.，這說明以AMGMs作為固定化基底，不僅可增大電極的比表面積，使Ab1的負載量成倍增加，而且由于其優異的導電性和生物相容性，能夠最大程度地保持抗體活性，增加電子轉移速率，具有很強的信號放大作用。

2.3 實驗條件的優化

為了有效地將所構建的電化學發光免疫傳感器應用于PSA檢測，本文對相關實驗條件進行了優化。

抗體濃度是決定傳感器性能的重要因素，因此，本實驗分別對Ab1和Ab2-B的質量濃度進行優化。如圖4A所示，ECL強度隨著Ab1質量濃度的增加而增大，當Ab1質量濃度超過12.0 μg/mL 后，ECL強度達到最大，繼續增大Ab1質量濃度，ECL則持續下降，這可能是由于電極表面區域限制了抗體的負載。此外，過飽和的負載量還會影響抗體的有效利用率，所以本實驗選用質量濃度為12.0 μg/mL的Ab1進行后續實驗。同理，抗體Ab2-B的質量濃度在5.0～10.0 μg/mL時，ECL呈上升趨勢，且在10.0 μg/mL處，ECL出現最大點，之后開始下降。因此，本實驗選擇10.0 μg/mL作為Ab2-B的最佳濃度。

AMGMs在電極表面的滴涂量也是影響ECL免疫傳感器性能的顯著因素。圖4B為AMGMs用量的優化曲線，可以看出當AMGMs體積從2.0 μL增加到10.0 μL時，ECL發光信號逐漸增加，當體積大于10.0 μL后，發光信號下降。這是由于AMGMs能夠有效增加電極的比表面積，提高電子轉移速率，但電極上過量的AMGMs會導致ECL背景信號的增加以及電子轉移速率的降低。因此，實驗最終選擇10.0 μL AMGMs為最佳用量。

圖4 實驗條件的優化

圖5 不同質量濃度PSA的ECL響應曲線

2.4 電化學發光免疫傳感器的性能分析

在上述優化條件下，利用所制備的電化學發光免疫傳感器對不同質量濃度的PSA進行定量檢測，結果如圖5所示。隨著PSA質量濃度的增大(從0.1 pg/mL 到50 ng/mL)，ECL響應逐漸增大。在該質量濃度范圍內，ECL的響應數值與logc呈良好的線性關系，線性擬合方程為IECL=507.63 logc+3 167.6，檢出限(S/N=3)為0.1 pg/mL。上述結果表明，該電化學發光免疫傳感器能夠有效地實現PSA的靈敏檢測。與國內外其它文獻的報道結果相比，該法得到的檢出限更低[21-23]，在臨床診斷與治療中具有更大的實用性。

為了考察該免疫傳感器對PSA的特異性，選取幾種干擾因子如BSA、 EB病毒核抗原1(EBNA-1)和EB病毒衍生的潛伏膜蛋白1(LMP-1)對其進行干擾實驗。在相同實驗條件下，在檢測體系中加入上述物質以考察傳感器的抗干擾能力。實驗發現，在上述干擾因子存在的情況下，檢測結果幾乎未改變，說明上述物質對PSA的干擾可忽略不計，表明該傳感器具有較高的特異性。

為了考察該傳感器的重現性，在相同條件下，對50 ng/mL的PSA進行連續多次檢測。所測的批內和批間相對標準偏差(RSD)分別為3.2%和4.3%，顯示該傳感器具有良好的重現性。穩定性也是免疫傳感器的一個重要指標。將制備好的傳感器放置在PBS(pH 7.4)中，4 ℃保存，30 d后檢測其 ECL信號。發現ECL強度仍可保留初始強度的90%，說明構建的傳感器具備優異的穩定性。

2.5 實際樣品的檢測

為了檢驗該傳感器在實際樣品分析中的準確性與實用性，本實驗采用制備好的傳感器用于檢測成年男性血清樣本中的PSA濃度，并通過測定質量濃度分別為10、30、50 ng/mL PSA抗原的回收率來研究人血清樣品中的PSA活性，每組至少檢測3次。結果表明，PSA抗原的回收率為98.2%～106%，說明該方法對人血清樣本中PSA抗原的檢測具有良好的準確性，該方法具有較好的臨床應用前景。

3 結 論

本文利用水熱法和原位還原法合成出三維花狀的Au@(MoS2/GO/o-MWNTs)納米復合物(AMGMs)，并將其作為一種理想的固定化基底，構筑了高靈敏的電化學發光免疫傳感器，用于檢測前列腺特異性抗原(PSA)。當底液中存在PSA時，修飾生物素的二抗(Ab2-B)可以通過三明治免疫反應組裝到電極表面，隨后，再利用生物素與親和素之間的特異性作用，將修飾Ru complex的親和素固定于電極上，通過測定Ru的電化學發光信號，定量檢測底液中的PSA濃度。該傳感體系不僅線性范圍寬，檢出限低，還具有結構簡單、特異性好、無污染等優點。此外，通過改變特異性抗體，該體系可以擴展到檢測其他疾病標志物，這意味著所構建的電化學發光免疫傳感器在疾病的早期診斷和分析中將展現巨大的應用前景。