超聲輔助離子液體分散液液微萃取/高效液相色譜法測定新型抗艾藥ACC007

龔愛琴,金黨琴

(揚州工業(yè)職業(yè)技術學院 化學工程學院，江蘇 揚州 225127)

艾滋病又名獲得性免疫缺陷綜合征，是由人免疫缺陷病毒感染導致的一種致死性較高的疾病。目前國際上治療艾滋病的藥物有6類30多種，分別為核苷類逆轉錄酶、非核苷類逆轉錄酶、蛋白酶、整合酶、融合酶和細胞內β趨化因子受體(CCR5)抑制劑[1]。ACC007屬于第三代口服非核苷類逆轉錄酶抑制劑，中文名為3-{[3-乙基-2,6-二氧-5-(丙基-2-基)-1,2,3,6-四氫嘧啶-4-基]羰基}-5-甲基苯腈。作為一類抗艾滋病新藥，ACC007具有優(yōu)良的抗病毒活性和安全性，在2017年獲得國家“十三五”重大新藥創(chuàng)制科技重大專項[2]。 藥品質量直接關系到用藥者健康和生命安全，藥物從研發(fā)到臨床必須進行質量監(jiān)控，包括對藥物制劑進行質量檢驗及對生物體液中的藥物濃度進行監(jiān)測，最常見的是對血清中藥物濃度進行監(jiān)測以了解藥動學特征[3]。目前關于ACC007含量的測定方法報道很少。黃潔瓊[4]采用液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法測定復方制劑和比格犬血漿中的ACC007，但液質聯(lián)用儀價格較高，一般實驗室難以普及。當分析基體比較復雜、物質含量較低的樣品時，常需結合使用分離富集技術。近年來分離富集技術向著簡單化、微型化、有機試劑消耗最小化方向發(fā)展，其中液相微萃取技術顯示了較高的樣品萃取能力和良好的富集效果[5-7]。疏水性離子液體具有在水中溶解度小、揮發(fā)性低、毒性低、環(huán)境友好等特點，逐漸取代傳統(tǒng)的有機溶劑而作為萃取劑使用。當使用離子液體作為萃取劑時，由于離子液體黏度較大，常需使用分散劑(甲醇[8]、乙腈[9]、丙酮[10-11]等)以改善離子液體在樣品溶液中的分散效果，提高萃取率，但會增大有機試劑消耗量。而使用超聲對溶液進行萃取時，溶液中會形成亞微米尺寸的液滴，增大互不相溶的兩相間接觸面，加速物質轉移，甚至無需分散劑也可獲得很高的萃取率，從而減少有機溶劑的使用[12-13]。

本文首次采用超聲輔助離子液體分散液液微萃取/高效液相色譜(HPLC)法測定人血清及藥片中的ACC007。實驗結果表明，在超聲的作用下無需分散劑即可獲得較高的萃取率(>94.0%)。該方法減少了有機溶劑的使用，簡單、環(huán)保，可為ACC007的藥動學和藥物研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)，配紫外檢測器；KQ3200超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；L2-4K臺式低速離心機(湖南可成儀器設備有限公司)；FE28 pH計(瑞士梅特勒-托利多)。

ACC007標準物質(含量99.7%)與藥片(標示量75.0 mg/片)均由江蘇艾迪制藥有限公司提供。

離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C8mimPF6]、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C6mimPF6]、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[C4mimPF6]購于上海笛柏生物科技有限公司。乙醇、甲醇、冰乙酸、乙酸鈉購于國藥集團化學試劑有限公司，甲醇為色譜純，其他均為分析純。實驗用水為高純水。

1.2 溶液配制

0.10 mg/mL ACC007標準溶液：稱取0.10 g ACC007標準物質置于燒杯中，用適量乙醇溶解后，轉入容量瓶中并用乙醇定容至100 mL，質量濃度為1.0 mg/mL，置于暗處保存。使用前取適量用乙醇稀釋至0.10 mg/mL。

pH 4.5的緩沖溶液：稱取5.0 g三水合乙酸鈉，用水溶解后，加入6.3 mL冰乙酸，用水稀釋至500 mL，于酸度計上調至pH 4.5。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備ACC007藥片：取5片準確稱重，研磨均勻，精密稱取約1片質量的藥品粉末，用乙醇溶解定容至100 mL，過0.45 μm濾膜，取0.1 mL續(xù)濾液萃取測定。

血清樣品：取健康志愿者的血清1.0 mL，加入1.0 mL 1.0 mg/mL的ACC007標準溶液和8.0 mL乙腈，以1 200 r/min離心15 min[14]，取0.5 mL上清液萃取分析。

1.3.2 萃取過程在10 mL離心管中，依次加入適量的ACC007標準溶液或樣品溶液、2.0 mL緩沖溶液、80 μL 離子液體[C8mimPF6]，用水稀釋至刻度線，搖勻。超聲10 min后取出，于5 ℃冷卻15 min，以2 500 r/min 離心5 min，溶液分層，下層即為離子液體萃取相。將萃取相用乙醇稀釋至1.0 mL，待測。

1.3.3 HPLC法測定色譜柱：Dionex C18(4.60 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇∶水(90∶10)，流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL。

圖1 未萃取藥物(a)、萃取試劑空白(b)與萃取后藥物(c)的吸收曲線

圖2 離子液體種類對ACC007萃取率的影響

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

實驗分別測定了未萃取藥物、萃取試劑空白、萃取后藥物在200～350 nm的吸收曲線，結果見圖1。由圖可知：藥物有2個吸收峰(圖1a)；萃取試劑空白在藥物第2個吸收峰處(260 nm)無吸收(圖1b)；藥物經萃取后第1個吸收峰消失(圖1c)，這可能是以萃取試劑空白作參比，而空白產生的吸收比樣品強所致。由于萃取試劑空白在第2個吸收峰無吸收，對測定無干擾，實驗選擇檢測波長為260 nm。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇離子液體的水溶性、粘度、萃取能力等會影響萃取率，當離子液體陰離子部分固定不變時，這些特性與離子液體的陽離子部分有關。[C4mimPF6]、[C6mimPF6]和[C8mimPF6]3種疏水性離子液體在水中的溶解度分別為18.8、7.5、2.0 μg/L[15]，因此分別考察了200 μL [C4mimPF6]、150 μL [C6mimPF6]、60 μL [C8mimPF6]在不使用分散劑的情況下對ACC007萃取率的影響(圖2)。萃取率計算如下：萃取率=CexVex×100%/(C0V0)，式中Cex、C0分別為萃取相和萃取溶液中ACC007的質量濃度(μg/mL)，Vex、V0分別為萃取相和萃取溶液的體積(mL)。由圖2可知，少量的[C8mimPF6]即可達到較高的萃取效果，故后續(xù)研究采用[C8mimPF6]作為萃取劑。

實驗同時考察了[C8mimPF6]用量的影響，結果發(fā)現ACC007的萃取率隨著離子液體用量的增加而增大，[C8mimPF6]用量為70 μL時達到最大萃取率(94.7%)，之后萃取率隨離子液體用量的增加基本不變。為便于操作，最終選擇離子液體[C8mimPF6]的用量為80 μL。

2.2.2 溶液pH值的選擇考察了溶液pH值在3.0～6.0范圍內對ACC007萃取率的影響，結果顯示，當溶液pH為4.5時萃取率達到最大值(95.0%)，此后萃取率隨著pH值的增大而降低。可能是因為ACC007發(fā)生了酮式和烯醇式結構的轉變，其在水中的溶解度隨著pH值增加而增大，導致萃取率下降。實驗中控制萃取溶液pH值為4.5。

2.2.3 萃取時間的選擇超聲輔助離子液體分散液液微萃取是一種平衡萃取，超聲波有利于疏水性離子液體形成微小液滴分散于水相中，從而加速萃取物的轉移。固定超聲頻率為40 kHz，實驗考察了超聲時間(2、5、7、10、15、20 min)對萃取率的影響，結果表明ACC007的萃取率隨著超聲時間的增加而增大，當超聲時間為10 min時萃取率達到最大值(95.4%)，之后隨超聲時間的增加萃取率基本不變。實驗選擇超聲時間為10 min。

2.2.4 冷卻時間與離心時間的選擇超聲時溶液溫度升高會增大離子液體的溶解度，冷卻可降低其在水中的溶解度而有利于相分離。在5 ℃冷卻溫度下，實驗考察了冷卻時間對ACC007萃取率的影響，發(fā)現冷卻時間超過10 min時即可相分離完全，ACC007的萃取率在94.0%以上。為保證分相完全，實驗選擇冷卻時間為15 min。

冷卻后立即離心，在轉速2 500 r/min條件下，考察了離心時間對ACC007萃取率的影響，發(fā)現離心時間為5 min時即可相分離完全，因此實驗選擇離心時間為5 min。

2.2.5 離子強度的選擇通過加入不同量的1 mol/L NaCl考察了離子強度對萃取率的影響，結果發(fā)現在10 mL萃取體系中，當NaCl的加入量超過0.9 mL(離子強度約為0.09 mol/L)時ACC007的萃取率會明顯下降。實驗使用的緩沖溶液濃度為0.2 mol/L，計算得離子強度為0.04 mol/L，可滿足離子強度的要求。

2.2.6 溶液體積的選擇考察了溶液體積對ACC007萃取率的影響，發(fā)現溶液體積超過15 mL后萃取率下降明顯，原因可能是溶液體積增大使得離子液體在水中的溶解量增大，萃取能力降低所致。本研究控制溶液體積為10 mL，萃取后為降低離子液體黏度的影響，將萃取相用乙醇稀釋至1.0 mL后測定。

圖3 經萃取后ACC007的色譜圖

2.3 分析應用

2.3.1 專屬性實驗圖3顯示了空白藥片(曲線1)、空白血清(曲線2)、ACC007標準溶液(曲線3)、ACC007藥片(曲線4)、加標血清(曲線5)經萃取后的色譜圖。由圖可知，ACC007的出峰時間為3.6 min，空白藥片與空白血清在該處均無色譜峰，表明空白藥片和空白血清中共存組分對測定無干擾。

2.3.2 線性關系與檢出限通過student's檢驗法比較工作曲線與標準曲線的斜率，考察了樣品基體對測定的影響。標準曲線通過萃取和分析ACC007標準溶液而得，工作曲線則通過萃取和分析加標空白藥片和血清而得。在優(yōu)化條件下，以峰面積對ACC007的質量濃度繪制曲線。結果表明，在P<0.05時標準曲線斜率與工作曲線斜率無明顯差異，因此實際樣品分析時均采用標準曲線法。由表1 可知，ACC007的線性范圍為0.20～10.0 μg/mL，在空白藥片和血清中的檢出限(S/N=3)分別為0.062、0.068 μg/mL。

表1 不同樣品中ACC007的線性參數及檢出限

2.3.3 重現性分別配制質量濃度為2.0、5.0、10.0 μg/mL的樣品溶液，按照本方法萃取后測定峰面積，每個濃度平行測定6次，ACC007峰面積的相對標準偏差(RSD)為2.8%～4.3%，表明方法的重現性較好。

2.3.4 樣品測定與回收率采用本方法測定了藥片與血清中ACC007的質量濃度(見表2)，將測定結果換算成原始量為：73.8 mg/片(藥片)，98.6 μg/mL(血清)。而ACC007藥片的標示量為75.0 mg/片，加標血清中ACC007的質量濃度為100.0 μg/mL。結果顯示，測定值與標示值無顯著性差異。

在2.0、5.0、10.0 μg/mL加標水平下，對上述藥片和血清樣品進行加標回收實驗，ACC007的回收率為90.5%～103%，RSD為2.9%～5.1%(見表2)，表明方法的準確性和重復性較好，可以滿足樣品的測定要求。

表2 樣品測定及回收率實驗結果(n=3)

3 結 論

本文建立了超聲輔助離子液體分散液液微萃取/HPLC測定血清和藥片中ACC007含量的分析方法。該方法無需使用分散劑，萃取率可達94.0%以上，減少了有機溶劑的使用和環(huán)境污染，降低了實驗成本；超聲作用提高了萃取效率。準確度、精密度、線性范圍、檢出限等實驗結果表明，該方法可用于血清和藥物的分析，為ACC007的藥動學和藥物研究提供了分析技術支持。