柴桂棗安湯對失眠模型大鼠的治療作用及其機制

胡春艷，郭齊，劉港，劉雪玲，查心儀，高雨欣，周睿晨，陸素琴

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.鎮江市中醫院腦病科，江蘇 鎮江 212003)

失眠是一種常見的臨床睡眠障礙疾病，主要表現為難以啟動或維持睡眠[1]。長期失眠不僅會帶來嚴重的精神心理負擔，還會引起機體抵抗力、注意力、記憶力等下降，且會增加患者心腦血管事件發生率[2-3]。目前，西醫臨床仍以藥物治療為主，但一些傳統的治療藥物存在不良反應多、藥物依賴性等缺陷[4]。中醫學中失眠癥屬于“不寐”范疇，中醫藥治療失眠不良反應小，無成癮性的優點使其受到越來越多的認同[5]。柴桂棗安湯為鎮江市中醫院陸素琴院長根據臨床多年經驗所得的經驗方，是以桂枝湯、小柴胡湯、甘麥大棗湯為基本方加減而成，主要由川桂枝、醋柴胡、炒白芍、淡黃芩、法半夏、酸棗仁、生龍骨等組成。目前，臨床研究表明柴桂棗安湯對肝膽氣滯型失眠的治療有顯著作用，但是其相關的作用機制尚不清晰。因此，本研究采用對氯苯丙氨酸(p-Chlorophenylalanine，PCPA)建立失眠模型大鼠，觀察其自發活動并分析血清生化指標，以初步探討柴桂棗安湯改善睡眠的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

雄性SPF級6周齡SD大鼠25只，體重(210.23±8.44)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。適應性飼養1周。本研究遵從國際有關動物實驗和臨床研究的基本倫理和準則，并通過江蘇大學動物倫理委員會批準。

柴桂棗安湯由鎮江市中醫院提供，組成：川桂枝9 g、醋柴胡20 g、炒白芍12 g、淡黃芩6 g、法半夏15 g、酸棗仁30 g、生龍骨30 g (先下)、生牡蠣30 g (先下)、制遠志15 g、合歡皮30 g、夏枯草10 g、川厚樸10 g、茯苓神30 g、夜交藤30 g、淮小麥30 g、炙甘草6 g、紅棗10 g、生姜6 g。

Bcl-2、 Bax、IL-2、IL-6、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP) ELISA檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 將25只大鼠隨機均分成 5 組，即正常組，模型組，陽性藥組，柴桂棗安湯高、低劑量組，每組5只。除正常組外，各組于每天8:00-9:00腹腔注射350 mg/kg的PCPA，按1 mL/100 g體重給藥，正常組給予等體積生理鹽水，連續注射3 d。觀察大鼠行為，出現晝夜節律消失表明模型制備成功。造模成功后第1天，柴桂棗安湯高(30 g/kg)、低劑量組(15 g/kg)，陽性藥組(地西泮1 g/kg)，按照1 mL/100 g體重灌胃給藥，正常組與模型組給予等體積生理鹽水，連續灌胃7 d。

1.2.2 大鼠自發活動實驗 造模成功后將大鼠置于干凈的飼養籠中提前適應3 min，記錄各組大鼠2 min內自主活動時間和前肢離地舉立次數作為正常活動反應指標。末次給藥后1 h再次測量各組大鼠上述指標。

1.2.3 血清生化指標分析 大鼠采用10%水合氯醛(360 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血8～10 mL，未抗凝；4 ℃凝固60 min；4 ℃，3 500 r/min離心15 min，取血清；于-80 ℃冰箱保存待測。按試劑盒說明書進行操作，檢測BDNF、Bcl-2、Bax、IL-2、IL-6、GFAP含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 柴桂棗安湯抑制失眠模型大鼠的自主活動

給藥前，模型組較正常組活動時間延長且站立次數顯著增加(P<0.05)，說明失眠模型建立成功。給藥后，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組活動時間較給藥前明顯縮短(P<0.05)，陽性藥組、柴桂棗安高劑量組站立次數較給藥前明顯減少(P<0.05)，說明柴桂棗安湯能抑制失眠大鼠的自主活動。見表1。

表1 柴桂棗安湯對大鼠活動時間及站立次數的影響

2.2 柴桂棗安湯對大鼠血清BDNF及GFAP含量的影響

與正常組比較，模型組血清中BDNF含量顯著降低(P<0.05)，GFAP含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組和柴桂棗安湯高劑量組血清中BDNF含量顯著升高(P<0.05)，GFAP含量顯著降低(P<0.05)，柴桂棗安湯低劑量組GFAP含量顯著降低(P<0.05)，BDNF含量有所升高但差異無統計學意義(P>0.05)；與柴桂棗安湯低劑量組相較，柴桂棗安湯高劑量組血清BDNF含量明顯升高，GFAP含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BDNF及GFAP含量比較

2.3 柴桂棗安湯對大鼠血清細胞因子含量的影響

與正常組比較，模型組血清中IL-6與IL-2含量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組大鼠血清中IL-6與IL-2水平顯著升高(P<0.05)；與柴桂棗安湯高劑量組比較，柴桂棗安湯低劑量組IL-6含量明顯升高(P<0.05)，IL-2含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清細胞因子含量比較

2.4 柴桂棗安湯對大鼠血清凋亡相關因子含量的影響

與正常組比較，模型組血清中Bcl-2含量與Bcl-2/Bax比值顯著降低，Bax含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥組、柴桂棗安湯高劑量組及低劑量組大鼠血清中Bcl-2含量及Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)，Bax含量無顯著性差異。柴桂棗安湯高劑量組血清Bcl-2含量與Bcl-2/Bax比值較柴桂棗安湯低劑量組顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清凋亡相關因子含量比較

3 討論

失眠是指患者對睡眠時間或質量不滿且影響白天社會功能的一種主觀體驗，是一種常見的睡眠障礙疾病[6]。其發病機制復雜，由身體因素及精神因素多方面影響，所以病程長且遷延不愈[7]。中醫學認為正常的睡眠依賴于“陰平陽秘”。若陰陽失交，則發為不寐[8]。該病病位在心，與肝脾胃腎密切相關。中醫藥可調整人體臟腑氣血的功能，改善患者睡眠狀況，且不會產生藥物依賴和嚴重的毒副作用，廣泛用于臨床[9]。本研究結果顯示，用柴桂棗安湯干預失眠模型大鼠后，大鼠的活動時間縮短且站立次數減少，說明柴桂棗安湯能有效抑制失眠大鼠的自主活動，改善其失眠癥狀。本實驗采用高、低兩個劑量對PCPA所致失眠模型大鼠進行干預，均對大鼠的失眠癥狀具有改善作用。

目前認為失眠的主要發病機制包括中樞神經遞質分泌的失調、γ-氨基丁酸能神經元系統功能受到抑制、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進、褪黑素分泌水平下降以及細胞因子分泌失調等[10]。神經營養因子參與神經元存活、生長并維持海馬結構，受損的神經元在其存在的情況下具有再生的能力[11]。BDNF是神經營養因子家族的重要成員，廣泛存在于中樞神經系統中，具有促進神經細胞生長發育，防止神經細胞損傷的功能。另外，BDNF還可參與調節睡眠—覺醒穩態[12]。本研究結果顯示，柴桂棗安湯能有效升高失眠模型大鼠血清中BDNF含量，且高劑量組較低劑量組升高更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與BDNF含量升高有關，且具有劑量依賴性。GFAP在中樞神經系統中具有調節神經系統發育，神經元的損傷、修復、再生和可塑性等作用[13]。GFAP為星形膠質細胞活化的標志物，其含量增高代表星形膠質細胞活化增加，神經元處于應激損傷狀態。星形膠質細胞能直接或活化后通過調控分泌多種細胞因子間接參與睡眠調控。本研究結果顯示，給予柴桂棗安湯干預后，失眠模型大鼠血清中GFAP含量顯著降低，且高劑量組較低劑量組降低更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與抑制星形膠質細胞增生活化有關，并且其對GFAP含量的降低作用具有劑量依賴性。細胞因子在神經-內分泌-免疫系統維持機體穩態中起重要作用。其中，IL-2能通過抑制脂質過氧化及升高Bcl-2基因表達從而抑制神經細胞凋亡[14]。IL-6與其受體結合后能與gp130結合形成二聚體從而發揮抗凋亡作用[15]。有研究表明IL-2、IL-6也可參與調節睡眠—覺醒穩態[16-17]。本研究結果顯示，柴桂棗安湯能有效提高失眠模型大鼠血清中與失眠相關細胞因子IL-2及IL-6含量，且高劑量組較低劑量組IL-2變化更為顯著，說明柴桂棗安湯可通過調節細胞因子IL-2及IL-6含量來干預失眠，并且對IL-2的調節呈劑量依賴性。細胞凋亡是一個由多基因控制細胞主動死亡的過程,主要受促凋亡基因和抑凋亡基因共同調節。Bcl-2蛋白可抑制細胞凋亡,而Bax可與Bcl-2結合，阻止Bcl-2激活，加速凋亡過程。既往研究表明，Bcl-2/Bax降低可能與睡眠剝奪有關[18-19]。本研究結果顯示，柴桂棗安湯能顯著升高失眠模型大鼠血清中Bcl-2含量，但對Bax含量無顯著影響，說明柴桂棗安湯主要通過調節血清中Bcl-2含量來調節Bcl-2/Bax比值。此外,給予柴桂棗安湯干預后失眠模型大鼠血清中Bcl-2/Bax比值有明顯的升高，且高劑量組較低劑量組升高更為顯著，說明柴桂棗安湯干預失眠的機制與調節凋亡相關因子Bcl-2/Bax有關，并且呈劑量依賴性。

本研究運用柴桂棗安湯干預腹腔注射PCPA致失眠大鼠，發現柴桂棗安湯干預失眠的機制可能與調節神經保護因子BDNF水平，凋亡相關因子Bcl-2、Bax和細胞因子IL-2、IL-6水平，抑制星形膠質細胞增生、活化有關。