地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參生長(zhǎng)、消化和免疫功能的影響

王旭達(dá)，關(guān)曉燕，王 鑒，董 穎，蔣經(jīng)偉，姜 北，李石磊，趙澤龍，陳 仲，高 杉，周遵春

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動(dòng)物門(mén)，是我國(guó)重要的近海水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[1]。使用抗生素及化學(xué)藥物來(lái)預(yù)防仿刺參病害不僅防治效果差，還會(huì)造成機(jī)體腸道菌群失衡、致病微生物劇增等不良后果[2-3]。將益生菌制劑作為飼料添加劑應(yīng)用于仿刺參養(yǎng)殖，不僅可以提高其非特異性免疫機(jī)能，還能提升仿刺參抗應(yīng)激及抵抗病害的能力[4-5]。

益生菌制劑是天然的免疫激活劑，可以提高干擾素及巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗病力[6]。同時(shí)，益生菌制劑本身含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨其在消化道內(nèi)代謝、繁衍，可產(chǎn)生多種維生素、氨基酸、有機(jī)酸等物質(zhì)，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7]。作為飼料添加劑使用是機(jī)體攝入益生菌最為實(shí)用、高效的方式[8]。目前，以芽孢桿菌(Bacillus)為主的益生菌制劑受到廣泛關(guān)注。芽孢桿菌通過(guò)發(fā)揮生物拮抗作用及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)抑制其他病原菌的生長(zhǎng)，還可以刺激淋巴組織進(jìn)入免疫準(zhǔn)備狀態(tài)，提高宿主的防御功能，起到增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用[9-10]。其中，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)是近年來(lái)益生菌菌株研發(fā)的熱點(diǎn)。地衣芽孢桿菌易于在機(jī)體腸道內(nèi)萌發(fā)生長(zhǎng)，對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、致病性弧菌(Vibrio)具有很強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸菌有促進(jìn)和共生作用[11-12]。由于地衣芽孢桿菌本身易形成孢子，比較適合于添加到飼料中保存[13]。地衣芽孢桿菌進(jìn)入機(jī)體腸道后，其表面抗原或代謝物擔(dān)當(dāng)免疫原，不斷刺激機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力[14-15]。同時(shí)，地衣芽孢桿菌還可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、空間競(jìng)爭(zhēng)等方式抑制有害微生物的生長(zhǎng)，維持機(jī)體腸道的微生態(tài)平衡[16]。

筆者以自健康仿刺參腸道中分離篩選得到的地衣芽孢桿菌為研究對(duì)象，將其制備成有活性的益生菌制劑并添加到飼料中開(kāi)展仿刺參飼養(yǎng)試驗(yàn)，以此驗(yàn)證其在仿刺參養(yǎng)殖中的益生作用。綜合評(píng)定地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參的生長(zhǎng)指標(biāo)、消化酶活性及免疫防御因子的影響，通過(guò)攻毒試驗(yàn)探究地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參抗病力的影響，旨在為地衣芽孢桿菌在仿刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供技術(shù)支持及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用仿刺參及飼料由遼寧省海水養(yǎng)殖引育種中心提供。仿刺參單體質(zhì)量(7.17±0.86) g，于人工育苗池暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間保持充氣，水溫16～18 ℃，pH 7.9～8.2，鹽度29.3～31.1。每日換水后投喂飼料，飼料日投喂量為仿刺參體質(zhì)量的3%～5%。試驗(yàn)用益生菌株篩選自健康仿刺參腸道內(nèi)壁，并經(jīng)16S rDNA同源分析法鑒定為地衣芽孢桿菌。攻毒試驗(yàn)所用病原菌為燦爛弧菌(V.splendidus)，分離自患腐皮綜合征的仿刺參病灶部位。以上2株菌種均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將-80 ℃冰箱凍存的地衣芽孢桿菌活化并重懸，將活化后的菌懸液以5%的接種量加入到MSB培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔3 h取3組平行樣，測(cè)其波長(zhǎng)在660 nm下的光密度值D660 nm，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將暫養(yǎng)7 d后的仿刺參隨機(jī)分配至5個(gè)相同規(guī)格720 mm×490 mm×380 mm水族箱中，每箱放入200頭仿刺參。將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加無(wú)菌海水重懸。采用比濁法將菌液與飼料的配比調(diào)整為105、107、109、1011cfu/g，將菌液與飼料充分混勻后進(jìn)行仿刺參投喂試驗(yàn)。試驗(yàn)期間保持充氣，飼養(yǎng)條件與暫養(yǎng)期一致。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理組，每組3個(gè)平行。分別于試驗(yàn)第0、10、20、30、40 d取樣測(cè)定仿刺參生長(zhǎng)、消化和免疫指標(biāo)。

1.2.3 仿刺參生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)測(cè)定仿刺參體質(zhì)量，并計(jì)算其質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率。質(zhì)量增加率(wWGR)及特定生長(zhǎng)率(RSG)按下式計(jì)算：

wWGR/%=(mt-m0)/mt×100%

RSG/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，mt為取樣時(shí)的仿刺參體質(zhì)量(g)，m0為仿刺參初始體質(zhì)量(g)，t為時(shí)間(d)。

1.2.4 仿刺參腸道消化酶活性的測(cè)定

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取5頭仿刺參，解剖仿刺參取腸組織，于冰盤(pán)上剔除腸道內(nèi)容物及腸系膜，用磷酸緩沖液(pH 7.5)沖洗后用濾紙吸干，以10倍磷酸緩沖液勻漿。勻漿液于4 ℃，3000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

采用南京建成科技有限公司測(cè)試盒測(cè)定仿刺參消化酶活性。胰蛋白活性單位定義：在37 ℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶在單位時(shí)間1 min內(nèi)使吸光度變化0.003為1個(gè)酶活性單位(U)。脂肪酶活性單位定義：在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmoL底物為1個(gè)酶活性單位(U)。淀粉酶活性單位定義：在37 ℃條件下，每毫克蛋白與底物作用30 min，水解10 mg淀粉為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.2.5 仿刺參體腔液中免疫指標(biāo)的測(cè)定

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取5頭仿刺參，瀝水10 min后用無(wú)菌注射器從仿刺參腹部抽取體腔液0.5 mL，置于預(yù)冷離心管中，合并體腔液。4 ℃，3000 r/min離心20 min，取上清液用于測(cè)定免疫酶活性。

采用南京建成科技有限公司測(cè)試盒測(cè)定仿刺參免疫酶活性。酸性磷酸酶活性單位定義：100 mL上清液在37 ℃與基質(zhì)反應(yīng)30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活性單位(U)。堿性磷酸酶的活性單位定義：在相同條件下，上清液與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)酶活性單位(U)。超氧化物歧化酶活性單位定義：每次反應(yīng)中酶抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為1個(gè)酶活性單位。溶菌酶的活性采用比濁法測(cè)定，根據(jù)37 ℃下，樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、蒸餾水與應(yīng)用酶液反應(yīng)時(shí)的透光度來(lái)計(jì)算樣品中溶菌酶的活性。

1.2.6 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的影響

為驗(yàn)證地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參的免疫保護(hù)效果，在投喂試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取20頭仿刺參用于燦爛弧菌攻毒試驗(yàn)。將活化的燦爛弧菌接種在2216E培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌水稀釋到一系列密度，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定燦爛弧菌對(duì)仿刺參的半致死密度為2×107cfu/mL。每頭仿刺參經(jīng)腹腔注射100 μL半致死密度的燦爛弧菌，記錄攻毒后各組仿刺參的吐腸率、累積死亡率及相對(duì)免疫保護(hù)率。攻毒14 d后，從每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取5頭仿刺參，解剖切取腸組織(長(zhǎng)約1 cm)，將同組仿刺參腸組織合并后放入組織勻漿機(jī)，加入30 mL磷酸緩沖鹽液，處理10 min。勻漿液于4 ℃，3000 r/min離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水將上清液稀釋10倍，取200 μL涂布至硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖弧菌選擇性培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)，2 d后統(tǒng)計(jì)各組仿刺參腸道弧菌數(shù)目。吐腸率(RE)、累積死亡率(RCM)及相對(duì)免疫保護(hù)率(RRPS)按下式計(jì)算：

RE/%=ne/n0×100%

RCM/%=(n0-nt)/n0×100%

RRPS/%=1-(dt/d0)×100%

式中，n0為仿刺參試驗(yàn)初始個(gè)體數(shù)，ne為仿刺參吐腸個(gè)體數(shù)，nt為仿刺參試驗(yàn)終末存活個(gè)體數(shù)，dt為攻毒組死亡率，d0為對(duì)照組死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析以及Duncan多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

地衣芽孢桿菌在培養(yǎng)的前6 h為生長(zhǎng)延滯期，培養(yǎng)6～18 h時(shí)細(xì)菌快速繁殖，活菌數(shù)增長(zhǎng)最快。在培養(yǎng)第18 h時(shí)菌液密度達(dá)到最大值。培養(yǎng)18 h后地衣芽孢桿菌活菌數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，細(xì)菌生長(zhǎng)趨于動(dòng)態(tài)平衡。穩(wěn)定生長(zhǎng)期維持約6 h后，地衣芽孢桿菌自身代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)阻礙了細(xì)菌的繁殖，細(xì)菌數(shù)開(kāi)始下降，進(jìn)入衰亡期(圖1)。

圖1 地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of B.licheniformis

2.2 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參生長(zhǎng)的影響

投喂地衣芽孢桿菌前，各試驗(yàn)組群中仿刺參個(gè)體平均濕質(zhì)量差別不大。至試驗(yàn)終止時(shí)，各試驗(yàn)組群仿刺參體質(zhì)量均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。其中地衣芽孢桿菌密度為109cfu/g的試驗(yàn)組仿刺參的質(zhì)量增加率及特定生長(zhǎng)率相對(duì)最高。而地衣芽孢桿菌密度為105、1011cfu/g的試驗(yàn)組仿刺參的質(zhì)量增加率及特定生長(zhǎng)率均低于對(duì)照組(表1)。

表1 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參質(zhì)量增加率和特定生長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effects of B.licheniformis on WGR and SGR of sea cucumber A.japonicus

2.3 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參消化酶活性的影響

不同密度地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的影響見(jiàn)圖2。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組仿刺參的胰蛋白酶活性均逐步增加，而107cfu/g組增加最快(圖2a)。在投喂10 d時(shí)，105cfu/g組與107cfu/g組的胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在投喂20 d后，105cfu/g組的胰蛋白酶活性增長(zhǎng)緩慢，而107cfu/g組與109cfu/g組的胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組仿刺參的脂肪酶活性均逐步增加(圖2b)。而107cfu/g組的脂肪酶活性上升更快，顯著高于同時(shí)期的對(duì)照組及試驗(yàn)組(P<0.05)。105、1011cfu/g組及對(duì)照組在投喂20 d后，脂肪酶活性增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩。與投喂初期的酶活性相比，109cfu/g組的脂肪酶活性在投喂30 d后明顯增長(zhǎng)(P<0.05)。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組仿刺參的淀粉酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(圖2c)。在投喂30 d時(shí)，各組仿刺參的淀粉酶活性達(dá)到最高，而后107cfu/g組和109cfu/g組淀粉酶活性緩慢下降，而105cfu/g組和1011cfu/g組淀粉酶活性下降較快，其中1011cfu/g組的淀粉酶活性低于同一時(shí)期的對(duì)照組，而107cfu/g組和109cfu/g組的淀粉酶活性與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。研究結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參腸道消化酶活性的作用效果與給予劑量、給予時(shí)間存在相關(guān)性。

2.4 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參免疫酶活性的影響

不同密度地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參體腔液免疫酶活性的影響見(jiàn)圖3。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組酸性磷酸酶活性均高于對(duì)照組(圖3a)。在投喂30 d后，107cfu/g組與109cfu/g組的酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而105cfu/g組與1011cfu/g組中酸性磷酸酶的活性與對(duì)照組相比差異不顯著。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組的堿性磷酸酶活性均逐步增加且高于同時(shí)期的對(duì)照組(圖3b)。其中，109cfu/g組堿性磷酸酶活性升高最多，107cfu/g組次之。二者堿性磷酸酶活性均顯著高于同時(shí)期的對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組與對(duì)照組的超氧化物歧化酶活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(圖3c)。在投喂30 d時(shí)，對(duì)照組及各試驗(yàn)組的超氧化物歧化酶活性達(dá)到最高。而在投喂30 d后，107cfu/g組與109cfu/g組的超氧化物歧化酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而105cfu/g組與1011cfu/g組中超氧化物歧化酶的活性與對(duì)照組相比差異不顯著。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)組與對(duì)照組的溶菌酶活性均逐步增加(圖3d)。在投喂20 d時(shí)，107cfu/g組與1011cfu/g組的溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而在投喂30 d后，1011cfu/g組的溶菌酶活性增長(zhǎng)緩慢，107cfu/g組與109cfu/g組的溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖3 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參酸性磷酸酶(a)、堿性磷酸酶(b)、超氧化物歧化酶(c)和溶菌酶(d)活性的影響Fig.3 Effects of B.licheniformis on activities of ACP(a),AKP(b),SOD(c) and LZM(d) of sea cucumber A.japonicus

2.5 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的影響

注射燦爛弧菌后，試驗(yàn)組與對(duì)照組仿刺參均出現(xiàn)不同程度的腫嘴、搖頭、吐腸等不良生理反應(yīng)。1011cfu/g組仿刺參的累積死亡率、吐腸率較高，相對(duì)免疫保護(hù)率較低。而107cfu/g組仿刺參的累積死亡率和吐腸率相對(duì)較低，相對(duì)免疫保護(hù)率較高(表2)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，107cfu/g組仿刺參腸道的燦爛弧菌數(shù)目最少，為0.04 cfu/μL。109cfu/g組次之，燦爛弧菌數(shù)為0.07 cfu/μL。二者的燦爛弧菌數(shù)目均明顯少于對(duì)照組和其他處理組(圖4)。這表明107cfu/g組的抑菌效果最明顯，可以有效提高仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的能力。

表2 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的影響Tab.2 Effects of B.licheniformis on disease resistance of sea cucumber A.japonicus against V.splendidus

圖4 地衣芽孢桿菌對(duì)攻毒仿刺參燦爛弧菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of B.licheniformis on V.splendidus in infected sea cucumber A.japonicus

3 討 論

3.1 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參生長(zhǎng)狀況的影響

質(zhì)量增加率反映的是一段時(shí)間內(nèi)動(dòng)物的體質(zhì)量增加量與初始體質(zhì)量的關(guān)系。質(zhì)量增加率只考慮終末質(zhì)量和初始質(zhì)量，不考慮養(yǎng)殖的時(shí)間，能夠直觀地反映動(dòng)物質(zhì)量增加情況和生長(zhǎng)情況[17]。特定生長(zhǎng)率是指生長(zhǎng)率與生長(zhǎng)天數(shù)的比值，體現(xiàn)單位時(shí)間內(nèi)質(zhì)量的變化，弱化了初始質(zhì)量對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的影響，是衡量水生動(dòng)物生長(zhǎng)狀況的常用指標(biāo)[18]。

本試驗(yàn)中，地衣芽孢桿菌過(guò)高或過(guò)低的添加密度均不利于提高仿刺參的質(zhì)量增加率及特定生長(zhǎng)率，這與韓莎等[19]的研究結(jié)果相似。出現(xiàn)這種情況的原因可能是，過(guò)低密度的地衣芽孢桿菌影響仿刺參對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，不能有效促進(jìn)仿刺參生長(zhǎng)，而過(guò)高密度的地衣芽孢桿菌會(huì)引起仿刺參腸道菌群失衡，導(dǎo)致仿刺參出現(xiàn)消化功能紊亂、代謝異常等現(xiàn)象，對(duì)仿刺參的健康養(yǎng)成產(chǎn)生不利影響。

3.2 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參消化酶活性的影響

消化酶活性的高低可以反映水生動(dòng)物消化能力的強(qiáng)弱[20]。通過(guò)向飼料中添加益生菌制劑可以提高機(jī)體的消化酶活性，進(jìn)而改善機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。本試驗(yàn)中，在添加地衣芽孢桿菌期間，仿刺參胰蛋白酶和脂肪酶的活力均呈上升趨勢(shì)，表明仿刺參對(duì)地衣芽孢桿菌具有逐漸適應(yīng)性，這與丁賢等[21]的研究結(jié)果相似。說(shuō)明不同密度地衣芽孢桿菌分泌的消化酶對(duì)仿刺參腸道的脂肪酶活性的影響具有選擇適應(yīng)性。隨著投喂時(shí)間的延長(zhǎng)，仿刺參淀粉酶活性出現(xiàn)先升后降的變化規(guī)律，這與于明超等[22]的研究結(jié)果相似。而當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌的添加密度為1011cfu/g時(shí)，其處理組的仿刺參淀粉酶活性低于對(duì)照組。出現(xiàn)這種變化趨勢(shì)的原因可能是過(guò)高密度的地衣芽孢桿菌影響到仿刺參腸道原來(lái)定殖的土著菌群生長(zhǎng)，而地衣芽孢桿菌分泌過(guò)量的消化酶對(duì)仿刺參自身的淀粉酶產(chǎn)生反向抑制作用，導(dǎo)致淀粉酶活性出現(xiàn)過(guò)飽和的現(xiàn)象[19]。

3.3 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參免疫酶活性的影響

仿刺參是無(wú)脊椎動(dòng)物，體內(nèi)沒(méi)有特異性的免疫組織，其體腔細(xì)胞擔(dān)負(fù)著非特異性免疫的職能[23]。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是仿刺參體腔細(xì)胞內(nèi)參與免疫防御活動(dòng)的重要水解酶[24]。超氧化物歧化酶可以清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化作用，修復(fù)受損細(xì)胞。溶菌酶能夠切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的糖苷鍵，引起細(xì)胞裂解，破壞和消除侵入機(jī)體內(nèi)的致病菌[25]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，合適密度的地衣芽孢桿菌可以提高仿刺參的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及溶菌酶活性，這與包鵬云等[26-27]的研究結(jié)果相似。而在投喂地衣芽孢桿菌期間，仿刺參超氧化物歧化酶活性總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)橐欢〞r(shí)期內(nèi)過(guò)量積累的超氧化物歧化酶造成機(jī)體的氧化壓力不足，氧化因子缺乏，難以維持正常所需[28]。這表明合適密度的地衣芽孢桿菌在仿刺參體內(nèi)能夠分泌相關(guān)非特異性免疫酶或者通過(guò)誘導(dǎo)激發(fā)的形式提高機(jī)體分泌相關(guān)酶的能力從而達(dá)到清除自由基、提高仿刺參抗氧化能力和免疫能力的目的。而過(guò)高劑量的地衣芽孢桿菌可能會(huì)引起機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的持續(xù)反應(yīng)而形成免疫抑制，導(dǎo)致相關(guān)免疫酶活力下降[29]。

3.4 地衣芽孢桿菌對(duì)仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的影響

燦爛弧菌是造成仿刺參腐皮綜合征病害發(fā)生的主要病原菌，對(duì)仿刺參養(yǎng)殖危害嚴(yán)重[30]。采用人工攻毒的方法使供試動(dòng)物感染病原體，以此來(lái)反映生態(tài)制劑對(duì)供試動(dòng)物的保護(hù)效果，能夠直接、真實(shí)地反映供試動(dòng)物所獲得的免疫抗病能力[31]。周慧慧等[32]通過(guò)燦爛弧菌攻毒試驗(yàn)證明，投喂益生菌制劑可以顯著提高仿刺參的抗病能力，同時(shí)有效降低仿刺參的累積死亡率。王金燕等[33]同樣利用攻毒試驗(yàn)證明，芽孢桿菌制劑可以顯著提高仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的能力。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌的添加密度為107cfu/g時(shí)，仿刺參發(fā)病的個(gè)體數(shù)量相對(duì)較少，吐腸率和累積死亡率較低，相對(duì)免疫保護(hù)率較高。同時(shí)，仿刺參腸道的燦爛弧菌數(shù)目也明顯少于其他處理組。這說(shuō)明合適劑量的地衣芽孢桿菌可以提高仿刺參抵抗?fàn)N爛弧菌感染的能力，而過(guò)高劑量的地衣芽孢桿菌可能會(huì)影響仿刺參腸道原來(lái)定殖的土著菌群生長(zhǎng)，破壞菌群平衡，使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響仿刺參攝食和消化吸收的效果。

4 結(jié) 論

綜上所述，該株地衣芽孢桿菌對(duì)促進(jìn)仿刺參生長(zhǎng)、提高消化酶活性、增強(qiáng)免疫防御功能具有顯著的益生作用。綜合各項(xiàng)指標(biāo)可見(jiàn)，當(dāng)飼料中地衣芽孢桿菌的密度為107、109cfu/g時(shí)，仿刺參的生長(zhǎng)性能、消化酶活性、免疫酶活性和抵抗?fàn)N爛弧菌的能力得到顯著提高。該株地衣芽孢桿菌可以作為一種安全有效的益生菌添加劑應(yīng)用于仿刺參養(yǎng)殖。