捕后干露對3種貝類活品品質的影響

閆麗新，姜明慧，劉俊榮，衣鴻莉，王選飛，田元勇

(大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023)

我國是貝類生產大國，2017年我國海水養殖貝類產量約1.5×108t，其中牡蠣、蛤和扇貝作為主要養殖經濟品種，產量分列前3位[1]。我國貝類養殖量居世界首位，但銷售端的品質和國外相比依然存在較大差距。目前，我國活貝運輸包括帶水運輸和無水運輸兩種方式，如蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)在產地周邊通常采用無水運輸方式，從產地運往廣州等地遠距離一般利用活水車進行運輸。菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)和長牡蠣(Crassostreagigas)采用無水運輸，到達零售端再放入海水中進行銷售。帶水運輸對于保持風味品質具有一定的優勢，但具有運輸成本高的缺點。無水運輸可降低運輸成本，目前實際操作更多依賴于經驗進行操作，缺乏科學指導。

貝類自采捕離水開始頻繁經歷無水環境，不同貝類對無水條件耐受程度也存在較大差異。蝦夷扇貝干露超過24 h后其生理狀態快速惡化進而導致死亡，但4 ℃條件下短期(24 h內)無水貯藏處置后復水,扇貝仍具有較好的恢復能力[2]。菲律賓蛤仔在4 ℃條件下干露24 h，復水后生理狀態幾乎能完全恢復[3-4]。而牡蠣具有更強的抗干露能力，4 ℃條件下無水貯藏后的半數致死時間為47.8 d[5]。此外，大量研究表明，不同貝類在面臨缺氧脅迫時存在不同的無氧代謝途徑。海洋無脊椎動物無氧代謝途徑主要有4種：葡萄糖—乳酸途徑、天冬氨酸—琥珀酸途徑、葡萄糖—奧品途徑和葡萄糖—琥珀酸途徑[6]。其中，葡萄糖—奧品途徑是奧品脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與特異性氨基酸還原縮合成奧品化合物，以產生氧化型煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)用來合成腺苷三磷酸(ATP)。貝類進行無氧代謝時，alanopine脫氫酶(ADH)、strombine脫氫酶(SDH)、章魚堿脫氫酶(ODH)和tauropine脫氫酶(TDH)活性較高，有研究報道，新鮮的牡蠣閉殼肌中，alanopine脫氫酶和strombine脫氫酶活性較高[7]，而蝦夷扇貝和菲律賓蛤仔則是章魚堿脫氫酶活性較高[8]。明確不同貝類干露耐受能力和生化代謝變化機理，對貝類捕后無水貯藏工藝的設定至關重要。

筆者選取菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝3種典型的經濟貝類為研究對象，分析無水貯藏條件下肌肉的pH、糖原含量、ATP關聯化合物含量、磷酸精氨酸含量及奧品脫氫酶活性等指標的變化規律，為建立貝類捕后無水貯藏工藝提供依據。

1 材料與方法

1.1 原料

蝦夷扇貝(142.4±22.15) g和長牡蠣(180.1±15.14) g分別于2019年3月31日和4月6日購自大連長興水產品市場，菲律賓蛤仔(13.6±0.71) g于2019年3月28日購自丹東水產公司，以上原料均用泡沫箱無水條件下密封，冰袋降溫后快速運至實驗室。原料到達實驗室后放入循環海水養殖槽內進行24 h緩沖處理。

1.2 預處理

3種活貝經緩沖處理后，分別進行干露貯藏(4 ℃冰箱，覆蓋海水濕布)，在貯藏的第1、2、4、8天分別取樣。去殼后取閉殼肌組織用液氮速凍后，用于分析。

1.3 方法

1.3.1 閉殼肌pH的測定

分別稱取2.0 g預處理的樣品，立刻加入10 mL 20 mmol/L碘乙酸鈉溶液，在冰浴條件下用玻璃棒將肌肉充分搗碎后靜置25 min，用精密pH計測定。每組3個平行。

1.3.2 閉殼肌中糖原含量的測定

取2.0 g 肉糜加入30% KOH溶液4 mL，沸水浴消化20 min。冷卻后加入20 mL無水乙醇，5650 r/min離心15 min后取沉淀作為粗糖原，采用蒽酮比色法測定其含量[9]。

1.3.3 閉殼肌中關聯化合物的提取及測定

分別稱取1.0 g閉殼肌，加入5% PCA溶液10 mL，在冰浴下用玻璃棒搗碎10 min，后用2 mol/L KOH調節pH在2.0～3.5，將其定容至20 mL，7300 r/min離心5 min，將上清液用0.45 μm濾膜過濾后，取4.0 mL加入0.1 mol/L磷酸緩沖液1 mL后等待分析。用高效液相色譜法對關聯化合物含量進行分析，選取大連依利特公司的色譜柱(SinoChrom ODS-BP 5 μm，4.6 mm×250 mm)，采用二極管陣列檢測器(DAD)，在254 nm、35 ℃、0.7 mL/min、進樣量0.02 mL的條件下進行檢測。流動相A：0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 6.5)，流動相B：V(流動相A)∶V(甲醇溶液)=8∶2[10]。

1.3.4 閉殼肌中磷酸精氨酸的測定

磷酸精氨酸和ATP及相關化和物的提取方法相同。參考文獻[10]的檢測方法，用高效液相色譜法進行測定。選取日本島津公司的色譜柱(Shim-pack CLC-NH26.0 mm×150 mm Shimadzu)，在柱溫40 ℃、波長205 nm的條件下進行檢測，流動相：10 mmol/LV(磷酸緩沖液)(pH 3.4)∶V(乙腈)=8∶2，流速為1.0 mL/min。

1.3.5 閉殼肌中奧品脫氫酶活性的測定

取橫紋肌3.0 g，加入0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖溶液15 mL。10 000 r/mim均質3次，每次30 s，其間隔30 s。后10 320 r/min離心10 min，上清液即為粗酶。用雙縮脲法[11]測定粗酶的蛋白含量。在4 ℃條件下進行整個提取過程。

奧品脫氫酶活性測定參考文獻[8]的方法，在反應體系中加入0.2 mmol/L還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸(NADH)，5 mmol/L丙酮酸，氨基酸底物，100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)，整個反應體系總體積為2.9 mL，加入0.1 mL粗酶使反應開始。章魚堿脫氫酶、strombine脫氫酶、alanopine脫氫酶、tauropine脫氫酶的氨基酸反應底物分別是5 mmol/L精氨酸、甘氨酸、丙氨酸和牛磺酸。酶活性單位(U)定義為每分鐘分解1 μmol NADH所需的酶量。

1.4 統計分析

試驗數據均采用平均值±標準差的形式表示，用SPSS軟件進行方差統計分析，用獨立樣本t檢驗對兩組間顯著性進行檢驗，顯著性水平設為0.05。使用Panel Check 1.4.2軟件對試驗數據進行主成分分析。

2 結 果

2.1 閉殼肌pH

菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝在無水貯藏過程中肌肉pH變化見圖1，初始pH分別為7.13、7.23和7.39，無水貯藏過程中，菲律賓蛤仔pH無明顯變化，長牡蠣和蝦夷扇貝pH分別降至6.88和6.80。相比于菲律賓蛤仔，蝦夷扇貝閉殼肌pH下降最明顯，其次是長牡蠣。

圖1 3種雙殼貝無水貯藏條件下pH的變化Fig.1 Changes in pH in three kinds of bivalves under air-exposure storage conditions同組內標有不同的字母表示有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)，下同.The means with different letters in the group are significant differences (P<0.05),and those with the same letter are no significant differences (P>0.05),et sequentia.

2.2 肌肉糖原

菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝在無水貯藏過程中糖原含量變化見圖2，初始糖原含量分別為23.1、7.8、36.5 mg/g，蝦夷扇貝糖原含量最高，其次是菲律賓蛤仔，長牡蠣最低。無水貯藏過程中，3種貝糖原含量均呈下降趨勢，8 d后分別降至7.3、2.3 mg/g和12.2 mg/g，蝦夷扇貝下降最明顯。

圖2 3種雙殼貝無水貯藏條件下糖原含量的變化Fig.2 Changes in glycogen content in three species of bivalves under air-exposure storage conditions

2.3 ATP及其關聯物

菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝在無水貯藏過程中ATP及其相關化合物含量變化見圖3，初始ATP含量分別為0.41、0.42 μmol/g和4.05 μmol/g，腺苷二磷酸(ADP)含量分別為0.77、2.35 μmol/g和0.38 μmol/g，菲律賓蛤仔和長牡蠣初始腺苷一磷酸(AMP)含量分別為1.35、2.14 μmol/g，蝦夷扇貝在初始點沒有AMP產生。無水貯藏過程中，菲律賓蛤仔和長牡蠣ATP含量無顯著變化，蝦夷扇貝ATP含量在第2天顯著下降并在第4天降至1.91 μmol/g。長牡蠣和菲律賓蛤仔ADP含量和AMP含量無顯著變化，蝦夷扇貝均呈現上升趨勢。

圖3 3種雙殼貝無水貯藏條件下ATP關聯化和物含量變化Fig.3 Changes in ATP and related compounds in three species of bivalves under air-exposure storage conditions

2.4 磷酸精氨酸

菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝在無水貯藏過程中磷酸精氨酸含量變化見圖4，蝦夷扇貝初始磷酸精氨酸含量為4.05 μmol/g，明顯高于菲律賓蛤仔，在牡蠣閉殼肌中未檢測到磷酸精氨酸。菲律賓蛤仔磷酸精氨酸含量在無水貯藏過程中無明顯變化，蝦夷扇貝在第2天顯著下降并在第4天降至0.65 μmol/g，無水貯藏過程中呈下降趨勢。

圖4 3種雙殼貝無水貯藏條件下磷酸精氨酸含量的變化Fig.4 Changes in arginine phosphate content in three species of bivalves under air-exposure storage conditions

2.5 奧品脫氫酶活性

菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝在無水貯藏過程中奧品脫氫酶活性變化見表1，菲律賓蛤仔初始章魚堿脫氫酶、strombine脫氫酶、alanopine脫氫酶、tauropine脫氫酶活性分別為355、32、44、12 mU/mg，無水貯藏過程中均無明顯變化，其中章魚堿脫氫酶活性遠高于另外3種奧品脫氫酶。牡蠣閉殼肌中沒有檢測到章魚堿脫氫酶活性，初始strombine脫氫酶、alanopine脫氫酶、tauropine脫氫酶活性分別為76、59、9 mU/mg，strombine脫氫酶和alanopine脫氫酶活性高于tauropine脫氫酶活性，無水貯藏過程中均呈上升趨勢。蝦夷扇貝初始章魚堿脫氫酶、strombine脫氫酶、alanopine脫氫酶、tauropine脫氫酶活性分別為1090、28、77、64 mU/mg，其中章魚堿脫氫酶活性最大，并且和脅迫強度呈現正相關性。

表1 3種雙殼貝無水貯藏條件下奧品脫氫酶活性變化Tab.1 Changes in the dehydrogenase activity of opine in three species of bivalves under air-exposure storage conditions

2.6 主成分分析

綜合菲律賓蛤仔、長牡蠣、蝦夷扇貝無水貯藏過程各理化指標進行主成分分析(圖5)。前2個主成分的累計貢獻率為99.7%，反映了原指標的大部分信息。3種貝大致分為3個區域，其中，菲律賓蛤仔(R)聚集在圖片下側，蝦夷扇貝(P)和長牡蠣(C)分別聚集在圖片左上側和右側。無水貯藏8 d內，長牡蠣各指標變化不明顯，而蝦夷扇貝和菲律賓蛤仔分別在第4天(P-4)和第8天(R-8)發生顯著性變化。

圖5 3種雙殼貝無水貯藏條件下主成分分析得分圖Fig.5 Principal component analysis (PCA) scores of three species of bivalves under air-exposure storage conditions

3 討 論

3.1 活力變化

捕后盡可能維持貝類生活相近的條件，對于維持其品質至關重要。但是考慮到貯運成本，無水貯藏是最經濟和常用的貯藏手段。目前，活貝捕后貯運方案更多依據感官經驗進行，缺乏理論支撐。本試驗結果顯示，捕后干露脅迫對菲律賓蛤仔、蝦夷扇貝、長牡蠣的影響有較大差異，生產中需要建立品種針對性的貯運方案。

首先，3種貝肌肉中糖原的初始含量差異明顯。蝦夷扇貝的運動方式與菲律賓蛤仔和牡蠣不同，如可以通過橫紋肌快速收縮進行游泳以躲避海星等捕食者等。因此蝦夷扇貝橫紋閉殼肌中儲備了更多的糖原[12-13]。此外有研究表明，季節對蝦夷扇貝糖原含量存在較大影響，其中8月左右糖原含量最高，而3月最低，ATP含量季節變化趨勢和糖原含量變化趨勢保持一致，這與其生殖周期密切相關[14]。ATP是一種高能磷酸化合物，可以為細胞各項生命活動提供能量。無水貯藏過程中氧氣不足導致ATP合成效率下降。為了維持機體代謝，磷酸精氨酸作為無脊椎動物體內一種重要的能量儲備，能夠在磷酸精氨酸激酶的作用下將ADP轉化成ATP，給機體提供一個ATP的緩沖庫，從而保證機體的能量供應處于平衡狀態[15-17]，因此，蝦夷扇貝閉殼肌具有更高的ATP和磷酸精氨酸水平。推測這種差異可能與3種貝的生活習性息息相關，在天然環境中，長牡蠣主要附著在其他物體上，菲律賓蛤仔一般埋棲在泥沙中，兩種貝均不需要消耗太高的能量。Storey[18]研究表明，牡蠣閉殼肌中存在磷酸精氨酸，在面臨缺氧時，組織中磷酸精氨酸儲量的減少和AMP含量的增加，加上低pH條件下磷酸精氨酸Ki值的增加，可以激活磷酸果糖激酶，幫助維持厭氧能量的生成。本試驗長牡蠣閉殼肌中未檢測到磷酸精氨酸，可能與長牡蠣在采捕過程中經歷了較大的脅迫有關。同時蝦夷扇貝對脅迫產生的反應最激烈，無水貯藏過程中能觀察到外殼的頻繁閉合活動，其結果導致糖原在短時間內大量消耗，在無水貯藏第4天，肌肉中糖原含量消耗過半，隨著磷酸肌酸和糖原逐漸耗盡，肌肉中的ATP迅速降解成ADP和AMP等物質，磷酸精氨酸也伴隨著ATP的消耗而急劇下降，在無水貯藏第2天產生AMP并且磷酸精氨酸顯著下降，鄭堯[19]也發現類似現象。其次，菲律賓蛤仔在無水貯藏期間也能觀察到外殼的開閉行為，無水貯藏第8天時，糖原也出現較大消耗。牡蠣無水貯藏過程幾乎都處于外殼緊閉狀態，無水貯藏8 d內幾乎未檢測到糖原的消耗。菲律賓蛤仔和牡蠣無水貯藏期間ATP一直維持在較低水平，沒有顯著變化。

3.2 代謝途徑

無氧代謝過程中，糖原進行無氧糖酵解生成ATP來為機體提供能量，此時ATP通過底物水平磷酸化而產生，NADH也在此過程中產生。為確保甘油醛-3-磷酸繼續氧化，糖酵解繼續進行，需要將NADH再氧化成NAD+。脊椎動物主要依靠乳酸脫氫酶發揮作用，而在海洋無脊椎動物中，不僅存在乳酸脫氫酶[20]，還存在奧品脫氫酶發揮同樣的作用[6]。并且，大多數海洋無脊椎動物的總奧品脫氫酶活性超過了乳酸脫氫酶活性[8]。在海洋無脊椎動物體內含有豐富的游離氨基酸，為細胞內奧品脫氫酶提供充足的反應底物[21-22]。奧品途徑相較于乳酸途徑的另一個優勢在于其終產物奧品在改變細胞內pH的程度上要比乳酸小的多，因此細胞內滲透壓更容易維持恒定[23]。而不同貝類面臨缺氧時代謝途徑存在差異，在絕大多數貝類中，章魚堿脫氫酶活性遠高于其他奧品脫氫酶[7]，如Haliotislamellosa[24]、Solenmarhinatus[25]等，也有少數貝類alanopine脫氫酶和strombine脫氫酶活性較高，如文蛤(Meretrixlusoria)[8]等。本試驗結果表明，在無水貯藏過程中菲律賓蛤仔和蝦夷扇貝章魚堿脫氫酶活性均高于另外3種奧品脫氫酶，而由于面臨缺氧時代謝途徑不同，在長牡蠣閉殼肌中未檢測到章魚堿脫氫酶活性，相應的alanopine脫氫酶和strombine脫氫酶活性較高。從酶活性應答可發現，物種不同導致奧品脫氫酶分布不同，不同貝類面對缺氧脅迫時奧品脫氫酶活性應答情況存在差異，各自應答機制不同[26]。在天然環境中，由于潮汐作用，菲律賓蛤仔和長牡蠣經常面臨干露脅迫，導致這兩種貝類進化出了更強的無氧呼吸能力，菲律賓蛤仔章魚堿脫氫酶活性在無水貯藏前4 d較穩定，在無水貯藏第8天顯著升高。而由于代謝途徑的不同，長牡蠣閉殼肌中alanopine脫氫酶和strombine脫氫酶活性較高，且在無水貯藏第8天顯著升高，表現出較好的耐干露特性。在無氧代謝過程中，一些有關能量代謝的小分子代謝產物，會抑制奧品脫氫酶活性，比如ATP，作為生物體內重要的高能磷酸化合物就對章魚堿脫氫酶展示出一定的抑制作用[27]，琥珀酸作為無氧代謝產物之一，對alanopine脫氫酶展示出一定的抑制作用[28]。另外，有研究發現，奧品脫氫酶活性在貝類肌肉組織中較高，并遠高于其他組織，因為在貝類肌肉組織中，環境型無氧代謝和功能型無氧代謝同時存在。另外貝類的閉殼肌在逃離天敵、追捕獵物等過程中起到重要作用，ATP在短時間內大量消耗，無氧代謝會產生一定的ATP，提供部分能量[25]。無氧代謝產生的酸性奧品化合物會使pH降低[29]，導致品質下降。

4 結 論

在4 ℃條件下無水貯藏過程中，3種貝應對無水脅迫的代謝途徑存在差異，蝦夷扇貝和菲律賓蛤仔以章魚堿脫氫酶代謝途徑為主，而長牡蠣以alanopine脫氫酶和strombine脫氫酶代謝為主。并且3種貝表現出不同的干露耐受性，長牡蠣至少在8 d內可保持較好的品質，而菲律賓蛤仔、蝦夷扇貝耐受時間為4、2 d。在捕后流通過程中，應根據耐受性的不同建立品種針對性流通方案。