實時熒光定量PCR技術在太湖藍藻監測和評估中的應用

周君薇，張麗娟，周宇昆，張效偉,3,*

1. 江蘇省環境經濟技術國際合作中心，南京 210000 2. 南京大學環境學院，南京 210023 3. 江蘇省生態環境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，南京 210023

藍藻大量繁殖所形成的有毒水華嚴重威脅飲用水安全，是全球性環境問題。水庫與湖泊是世界各國重要的公共給水水源之一。隨著國民經濟與社會的發展，湖泊富營養化加劇，藻類水華暴發頻率增高，富營養化是我國湖泊的主要問題，成為制約流域社會經濟持續發展的環境問題[1]。富營養化的淡水中，藍藻是水體中水華的主要組成，藍藻中包含了多種具有產生毒素及嗅味物質這2類代謝物的藻種[2]，例如：微囊藻(Microcystisspp.)、柱孢藻(Cylindrospermosisspp.)等，會產生微囊藻毒素(microcystin, MC)、柱孢藻毒素(cylindrospermopsin, CYN)和蛤蚌毒素(saxitoxin, STX)等；魚腥藻(Anabaenaspp.)、假魚腥藻(Pseudanabaenaspp.)等會產生土臭素(geosmin)、2-甲基異茨醇(2-methylisoborneol, 2-MIB)等嗅味物質。當飲用水源中存在藻類毒素與嗅味物質時，除了影響飲用水的安全外，對飲用水的水質會產生影響，因此是管理及供水部門面臨的重要議題。

太湖是我國受藍藻水華暴發影響水質安全問題最突出的地區。太湖周邊經濟發達的重要城鎮高度依賴太湖水資源，而近年來太湖卻深受藍藻水華的影響。為了有效管理太湖的水資源，基于藻藍素及葉綠素監測的藍藻在線自動監測系統被廣泛應用，以便實時了解水體中藍藻數量，達到預警目的。然而許多環境樣品分析研究指出，同一藻種的藍藻中，可分為具有產毒能力和不具產毒能力的藍藻，兩者不僅時常同時存在[3-5]，且從形態學上無法區分[6]，因此準確辨別藍藻種類至關重要。

基于DNA的分子檢測方法為環境生物監測提供了精準高效的替代技術。有別于傳統生物性監測(如藍藻顯微鏡鏡檢)，實時熒光定量PCR(qPCR)技術是發展相對更為健全且能廣泛運用的生物監測方法。通過專一性的引子(primer)和探針(probe)，得以快速了解當下污染物種類(定性)及污染程度(定量)。因此，可依據藍藻產生藻類毒素及嗅味物質的生化反應途徑，找出合適的功能性基因，以qPCR快速定量水體中具有產生藻類毒素/嗅味物質能力的藍藻數量，可作為分析水體中二次代謝物存在程度的依據。同時整合傳統分析法(毒素的ELISA法及嗅味素的SPME-GC-MS法)與qPCR定量系統的分析結果，可找出藻類代謝物與基因量、藍藻細胞數之間的相關性，大幅提高藻類計數的時效性[7-8]，也可克服傳統分析方法的缺點，如耗時過長、無法清楚區分藻種以及無法利用肉眼判斷藻種是否產生毒素或嗅味物質等。

盡管分子監測技術已經取得長足進步，如何將其應用于水生態環境管理仍然面臨挑戰。在過去20年間，有許多研究都在利用qPCR技術定量產毒及產臭基因區段。在產MC基因方面，qPCR的分析結果與MC有良好的相關性[9-16]；在產CYN基因方面，亦有許多研究都在利用qPCR來定量產毒柱孢藻的數量[11-20]；而在產2-MIB基因方面，以qPCR定量產2-MIB基因的研究相對較少[21-22]。本研究重點將應用基于qPCR技術的快速分子監測技術，分析產毒微囊藻、產毒柱孢藻和產2-MIB基因；同時采用酶聯免疫法(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)分析MC和CYN這2種毒素，并用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)分析嗅味物質2-MIB。2019年7—12月開展連續監測，建立太湖本土化水源地的相關數據庫，以便實時掌握太湖水體中藻類毒素及嗅味物質的潛在風險，及時將分析結果反饋給管理部門，讓管理部門有足夠的時間啟動緊急應變程序，為水源安全提供快速且有效的保障。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集點位

根據江蘇省環境監測中心針對太湖全區水質監測的例行點位進行采樣，采樣點位均勻分布于全湖各處(圖1)，總共24個采樣點。太湖是典型的淺水性湖泊，采樣點水深都在2 m左右，采樣深度<0.5 m。由于夏季氣溫高，適合藍藻大量生長，為了解不同季節藍藻的狀況及分布，2019年7—12月，每月采樣1次，其中8月及9月為太湖水華好發期，因此這2個月額外增加一次采樣，共8次采樣。

1.2 DNA提取方法

為有效達到破壞藻體細胞壁的目的，在DNA提取前利用玻璃珠破壁技術。將10 mL樣品過濾至0.22 μm的醋酸纖維濾紙后，置于1.5 mL的離心管中，而后于離心管中加入400 μL緩沖液，利用振蕩器(SI-G560, Vortex-Gene 2, Scientific Industries，美國)震蕩10 min，在65 ℃溫度下反應10 min后，便可開始進行DNA提取。DNA的提取則選用植物基因組DNA提取微型套組(DNA-0301, Plant Genomic DNA Extraction Mini Kit，綠準生物科技有限公司，中國)，最后可取得100 μL的DNA提取液。

1.3 qPCR定量系統

利用實時定量聚合酶鏈式反應(qPCR) (CFX Connect, Real-Time PCR Detection System, BIO-RAD，美國)進行目標基因的定量分析。qPCR操作條件：首先以95 ℃預先反應300 s，之后開始進行循環放大步驟，每次循環包括95 ℃下變性10 s、60 ℃下接合20 s，此步驟重復40個循環，并于單次循環結束后獲得波長519 nm的熒光強度值。本研究采用功能性基因作為藍藻定量標準，參照Chiu等[7, 22]的研究方法，將包含產毒微囊藻基因、產毒柱孢藻基因和產2-MIB基因，以10倍序列稀釋取得各濃度標樣，測定范圍如表1所示。

1.4 藻類毒素的定量分析

采用商品化的盤式酶聯免疫套組(ELISA Kit)(微囊藻毒PN 520012、柱孢藻毒PN 522011，Abraix LLC，美國)[23]，參照套組所附的標準作業程序進行分析，用多孔吸光分光亮度儀(Multiskan FC，Thermo Scientific，芬蘭)在450 nm波長下取得吸光值，并經由標準曲線回推取得MC和CYN濃度。樣品分析前，先以快速冷凍破壁技術進行樣品前處理，利用液態氮快速凍溶方式，確保目標微生物體得到有效破壞，使藻體內部的藻毒素完全釋出到水體中，再經0.22 μm濾膜過濾，去除樣品中細胞殘骸等懸浮性物質，以免干擾后續分析。

圖1 太湖監測點位分布圖Fig. 1 Distribution map of routine monitoring points in Lake Tai

1.5 嗅味素的定量分析

參照Lin等[24]的方法，于50 mL的樣品中加入15 g的氯化鈉，以固相微萃取法(solid phase micro-extraction, SPME)于65oC恒溫水浴下吸附30 min，將水樣中嗅味物質吸附于吸附纖維上，再用GC-MS(6890/5973，安捷倫，美國)，將吸附完畢的吸附針注入GC-MS，定量分析嗅味素。

1.6 分析靈敏度與質量控制

分析技術的質量控制(quality control)規范如表2所示，用以確認分析是否受到環境基質干擾。

1.7 統計分析

利用SPSS 17.0統計軟件(IBM，美國)針對傳統分析法與qPCR技術的結果進行線性回歸分析，同時用公式(1)計算線性回歸在95%置信水平下的預期區間[25]。

(1)

表1 分析方法測值范圍Table 1 Concentration range for each analytical method

表2 樣品質量控制規范Table 2 Quality control for sample measurement

利用皮爾遜相關系數γ(Pearson’s Correlation Coefficient)分析基因和藻類毒素、嗅味物質的相關性。當相關系數為0.3以下時為低相關，0.3～0.7為中等相關，0.7以上為高度相關。

2 結果(Results)

2.1 太湖藍藻基因和代謝物的時空分布2.2.1 藍藻產毒基因的時空分布

太湖產毒微囊藻基因的拷貝數范圍為55～2.48×107copy·mL-1，平均值為7.83×105copy·mL-1。產毒微囊藻基因具有明顯的時空分布特征。時間上，產毒微囊藻基因的豐度在7、8月不斷上升，9月達到最高值，10—12月逐漸下降(圖2(a))。空間上，產毒微囊藻基因呈現出西部最高，北部次之的空間分布特征，其中太湖西北部的竺山湖心7月的產毒微囊藻基因的拷貝數達到2.48×107copy·mL-1，北部的梅梁灣在9月上旬的產毒微囊藻基因的拷貝數達到1.24×107copy·mL-1(圖3)。

太湖產毒柱孢藻基因的拷貝數介于ND～1.96×106copy·mL-1，平均值為2.99×104copy·mL-1，明顯低于產微囊藻毒素基因。太湖產毒柱孢藻基因在7、8月達到最高值，9—12月逐漸下降(圖2(b))。總柱孢藻基因和產毒柱孢藻基因具有相似的時間分布規律，產毒柱孢藻基因/總柱孢藻基因的比值范圍為4.1%～100%，平均值為88.9%，說明絕大多數柱孢藻都含有產毒素的基因。產毒柱孢藻基因顯示區域性分布差異，北部和東部的產毒藻基因的拷貝數較高，如太湖東北部的五里湖心在7—11月的藻毒素基因的拷貝數均高于3.98×104copy·mL-1(圖4)，明顯高于其他點位。

太湖產2-MIB基因豐度介于ND～2.11×106copy·mL-1之間，平均濃度為1.52×102copy·mL-1，其濃度在7、8月維持較高水平，9月開始不斷下降(圖2(c))。空間上，東部(尤其東南區)的產2-MIB基因濃度較高，其中7月東南部廟港的產2-MIB基因濃度最高，8月上旬漾西港的濃度達到4.19×106copy·mL-1(圖5)。

2.2.2 藍藻毒素、嗅味物質的時空分布

MC太湖檢出的平均濃度為4.1 μg·L-1，最高濃度出現在9月下旬的東部位點新塘港，達到674.47 μg·L-1，其余位點的濃度均低于10 μg·L-1。MC和產毒微囊藻基因具有相似的時空分布特征。時間上，MC在9月上旬達到最高值，之后逐漸下降。空間上，MC的平均值也呈現出以西區(尤其西北部)較高的分布格局，其中9月上旬有6個采樣位點的MC濃度高于世界衛生組織推薦的標準(1 μg·L-1)，均位于太湖西部和北部，竺山湖和梅梁湖的濃度最高，分別達到7.53 μg·L-1和6.22 μg·L-1。

CYN在太湖的檢出范圍為ND～1.5 μg·L-1，平均濃度為0.2 μg·L-1。相比產毒柱孢藻基因，CYN隨著時間的變化滯后，在7—9月濃度較高，之后逐漸下降(圖2(b))。CYN和產柱孢藻基因的空間分布格局相似(圖4)，東部和南部的濃度明顯高于其他區域，其中五里湖、西山西和澤山3個點位在8月下旬檢出濃度偏高，分別達到1.50、1.17和1.02 μg·L-1。

太湖2-MIB嗅味物質整體濃度范圍介于ND～1 122.8 ng·L-1，平均濃度為41.2 ng·L-1。2-MIB嗅味物質和基因濃度隨時間的分布一致，均在8月達到峰值，之后逐漸下降(圖2(c))。2-MIB在太湖東部(尤其東南部)的濃度較高，另外7—9月在太湖北部竺山湖和梅梁灣也檢出較高濃度的2-MIB(圖5)。

2.2 太湖藍藻產毒基因預測代謝產物

產毒微囊藻基因與MC濃度具有中等相關性，皮爾遜相關系數γ為0.572 (P<0.01；圖6(a))，其中有95.5%的數據會落在95%的預測區間內。同樣地，產毒柱孢藻基因與CYN濃度呈中等相關，其皮爾遜相關系數γ為0.504 (P<0.01；圖6(b))，其中有94.8%的數據會落在95%的預測區間內。而在2-MIB方面，產2-MIB基因與2-MIB濃度有中度到強度的相關性，其皮爾遜相關系數γ為0.652 (P<0.01；圖6(c))，其中有97.2%的數據會落在95%的預測區間內。由相關性分析獲得的相關公式可用于后續由基因濃度判斷藻類毒素或是嗅味物質濃度的主要參數。

2.3 太湖藍藻污染的環境影響因素

總微囊藻基因與pH呈顯著正相關，與電導率呈顯著負相關，產毒微囊藻和MC與溶解氧均呈顯著負相關。柱孢藻基因未呈現出和環境因子的顯著相關性，但是柱孢藻毒素呈現出與pH顯著正相關，與電導率顯著負相關。產2-MIB基因和嗅味物質均呈現與溫度顯著正相關(表3)。

圖2 各月份藍藻基因、毒素及嗅味物質的濃度變化Fig. 2 Concentration distribution of cyanobacteria gene, toxins and odorants in different months

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產毒微囊藻基因Microcystin-producing gene of MicrocystisMC時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December微囊藻毒素/(μg·L-1)Microcystins/(μg·L-1)產毒微囊藻基因Microcystin-producing gene of MicrocystisMC

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產毒柱孢藻基因Cylindrospermopsin-producing gene of CylindrospermosisCYN時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December柱孢藻毒素/(μg·L-1)Cylindrospermopsin/(μg·L-1)產毒柱孢藻基因Cylindrospermopsin-producing gene of CylindrospermosisCYN

時間Time7月July8月上旬Early August8月下旬Late August9月上旬Early September基因/(copy·mL-1)Gene/(copy·mL-1)產2-MIB基因2-MIB synthesis gene2-MIB時間Time9月下旬Late September10月October11月November12月December嗅味物質/(ng·L-1)Odorant/(ng·L-1)產2-MIB基因2-MIB synthesis gene2-MIB

圖6 太湖藍藻各基因與其代謝物的相關性分析注：(a) N=177；(b) N=100；(c) N=108；基因單位為copy·mL-1，MC和CYN濃度單位為μg·L-1，2-MIB濃度單位為ng·L-1。Fig. 6 Correlation analysis of genes and metabolites of cyanobacteria in Lake TaiNote: (a) N=177; (b) N=100; (c) N=108; the units of genes were copy·mL-1, the units of concentrations of MC and CYN were μg·L-1，the units of 2-MIB concentrations were ng·L-1.

3 討論(Discussion)

不同類型的產毒藻基因在太湖具有顯著的時空分布差異。時間上，產毒微囊藻基因在9月達到濃度峰值，產毒柱孢藻和產2-MIB基因則在7、8月維持較高濃度。空間上，產毒微囊藻基因在西部(尤其西北部)的拷貝數更高，已有研究也表明，太湖西北部藍藻水華暴發頻繁，這可能由西北部的地理位置、沉積環境及入湖河流的污染等多種因素綜合導致。產毒柱孢藻基因在北部和東部的拷貝數更高，產2-MIB基因則在東部(尤其東南部)的拷貝數更高。

太湖各項藍藻產毒基因與二次代謝物具有良好相關性。藍藻的基因和代謝產物的相關性系數反映了單位產毒基因表達轉化成毒素/嗅味的能力，相關性系數越高，代表具有產毒基因的藍藻產生毒素/嗅味的能力越強，反之亦然。太湖3種藍藻產毒基因和其代謝產物均呈中度相關，說明基于產毒微囊藻基因的豐度可以有效預警藍藻污染，并推測藍藻的生成趨勢。不同藍藻基因和代謝物受環境因子的影響不同，產毒微囊藻和微囊藻毒素和溶解氧均呈顯著負相關，柱孢藻毒素呈現出和pH顯著正相關，和電導率顯著負相關。產2-MIB基因和嗅味物質均呈現與溫度顯著正相關。

表3 藍藻基因/毒素/嗅味與環境因子的相關性Table 3 Correlation between cyanobacteria genes/toxins/odorants and environmental factors

太湖藍藻的毒素、嗅味物質和相應基因在時空上的分布格局相似。太湖產毒微囊藻基因與微囊藻毒素的線性回歸模型的斜率為0.0936，與Chiu等[7]報道的斜率(0.374)[11]有差異。中國太湖產毒柱孢藻基因與柱孢藻毒素的回歸斜率為0.0411 (圖6(b))，有異于中國臺灣地區的斜率(0.142)；而在2-MIB方面，中國太湖2-MIB的回歸斜率為0.291，小于中國臺灣地區的斜率[22]。以上結果表明，中國太湖的產毒微囊藻、產毒柱孢藻和產2-MIB的藍藻在生理特性與中國臺灣地區的有明顯的差異，中國太湖地區的斜率普遍小于中國臺灣地區的，可知在同一基因水平上中國臺灣地區的藍藻毒素及嗅味問題較太湖更為嚴峻。

目前太湖藍藻的研究仍集中在微囊藻及毒素方面，太湖中微囊藻毒素的平均濃度達4.1 μg·L-1，明顯高于柱孢藻毒素(0.2 μg·L-1)和2-MB(41.2 ng·L-1)，表明太湖藍藻水華主要由微囊藻導致，但是柱孢藻毒素在太湖的局部區域構成低風險，其在五里湖、西山西和澤山3個點位在8月下旬檢出濃度分別達到1.50、1.17和1.02 μg·L-1，超過澳洲飲用水的建議值1 μg·L-1[26-27]，建議加強對太湖其他產毒藍藻的研究。此外，太湖8月上旬和下旬分別有21個和22個點位的2-MIB濃度高于我國的建議值10 ng·L-1[28]，而所有樣品中有53%高于我國建議限值，最大濃度(1 123 ng·L-1)更遠高于我國建議限值，為限值的112倍，說明太湖存在較高的2-MIB風險。2-MIB影響飲用水水質，且在水體中不易快速降解，建議持續關注產2-MIB基因及嗅味物質的濃度變化。

太湖的飲用水源地2-MIB風險顯著高于MC和CYN。本研究共設置了5個飲用水源地點位，分別為寺前、漁洋山、金墅港、錫東水廠和廟港。相比其他采樣點，飲用水源地的MC濃度較低，產毒微囊藻基因的豐度范圍為55.4～1.73×106copy·mL-1，MC濃度均低于飲用水推薦濃度1 μg·L-1，其中錫東水廠和漁洋山的產毒微囊藻基因和MC濃度略高于其他飲用水點位，9月的MC濃度高于其他月份。飲用水源地的CYN濃度范圍為0～0.86 μg·L-1，7、8月的濃度偏高，其中廟港和漁洋山的濃度略高于其他水源地。毒素2-MIB的濃度范圍為0～412.46 ng·L-1，其中有65%的樣品濃度高于我國建議限值10 ng·L-1，8、9月的濃度偏高，尤其在廟港、漁洋山和金墅港，說明太湖的飲用水源地存在較高的2-MIB風險，可能威脅到飲用水供應安全，應該重點關注。

與傳統形態學相比，分子監測方法具有檢測限低、檢測范圍廣等技術優勢。本研究以產毒微囊藻基因、產毒柱孢藻基因和產2-MIB基因為靶向基因，通過qPCR方法定量檢測7—12月太湖產生藻類毒素/嗅味物質的藍藻數量。qPCR技術定量藍藻基因的檢測區間為2.5 ×101～2.5×107copy·mL-1，同時提供不同功能性基因的豐度變化。結果顯示，產毒微囊藻基因的平均拷貝數最高，達到7.83×105copy·mL-1，產毒柱孢藻基因次之(2.99×104copy·mL-1)，產2-MIB基因的拷貝數較低，為1.52×102copy·mL-1。總微囊藻的基因拷貝數(16S rDNA基因檢測)隨時間變化趨勢與產毒微囊藻的基本一致，每月檢測到的產毒微囊藻基因均低于總微囊藻的，說明自然水體中同一藍藻物種的有毒和無毒菌株通常共存。產毒微囊藻基因/總微囊藻基因的比值為7.6%～35.9%，說明仍有高豐度的微囊藻菌株不具有產藻毒素的潛力。相反，產毒柱孢藻基因/總柱孢藻基因的比值范圍為4.1%～100%，平均值為88.9%，說明絕大多數柱孢藻都含有產毒素的基因。因此，采用產毒基因的拷貝數預測藻種的產毒能力更加準確。

本研究通過qPCR技術對太湖的3種關鍵產毒基因進行連續系統的監測與分析，發現產毒基因和基于傳統方法監測的毒素、嗅味濃度具有較高的相關性，證明基于DNA的分子檢測方法可快速準確地對產毒藻進行監測和預警，為管理部門進行藍藻水華風險評估和管理提供技術和數據支撐，對保障該區域的飲用水安全具有重要意義。