25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對水生無脊椎動物的毒性效應及生態風險評估

曾兆華，湯保華，林濤，林嶺虹，楊廣，金菁，朱珍珍，方慧玲，游泳,*

1. 福建省農業科學院植物保護研究所，福州 350013 2. 蘇州華測安評技術服務有限公司，蘇州 215121 3. 福建農林大學植物保護學院，福州 350002

水稻是我國重要的糧食作物。近年來，千金子、馬唐和旱稗等是我國南方稻田主要為害雜草[1]，主要依賴除草劑進行防治。隨著除草劑使用量不斷加大，稻田附近水域中農藥的檢出率也隨之增高。因此，需要對農藥的使用進行監測和控制，并加強生態風險評價。農藥生態風險評價是農藥登記不可缺失的環節[2]，傳統的生態危害評估通常是基于室內化學品對單一物種的急、慢性毒性試驗結果，而無法對自然生態系統中的種內、種間關系進行有效反映[3]。在2017年11月起施行的《農藥登記資料要求》中，增加了化學農藥制劑產品需提供環境風險評估報告的要求[4]，運用環境暴露模型評估化學農藥制劑應用后對水生生態系統的風險是國際通行做法[5]。目前，國際上已建立了用于評估農藥對地表水污染風險的初級模型[6-7]和高級模型[8-12]；在2010年，我國與荷蘭科研人員合作研發出可用于我國農藥暴露模擬的TOP-RICE模型[6,13]，但國內外構建的模型通常是基于實驗室單一物種毒性測試結果而顯得過于保守，相反采用物種敏感度分布(SSD)研究等高級效應分析方法能最大程度地接近實際環境條件，并確定初級評估中所識別風險存在的可能性[14]。

大型溞(Daphniamagna)因對環境中的多種化學物質表現出高度敏感性等優點，被廣泛應用于水環境污染的檢測和風險評價中[15-17]，但其主要分布在我國北方，南方少見[18]，以其作為評價南方水田除草劑的環境風險具有一定局限性。發頭裸腹溞(Moinairrasa)分布于我國各地，尤其是南方各省[11]，其內稟增長率(rm)為大型溞等溞屬動物2倍～3倍以上[19]，是一種新的較為理想的試驗材料[20]，但有關將發頭裸腹溞應用于生態風險評價的報道還很少。

五氟磺草胺是一種三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑，通過抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)發揮對雜草的控制作用[21-23]，可有效防除稗草、千金子等禾本科雜草以及一年生莎草科雜草，并對眾多闊葉雜草有效[24]，在世界各地水稻田中廣泛使用[25]。2004年9月24日五氟磺草胺在美國環境保護局(US EPA)正式注冊登記，2005年在美國南部稻區推廣應用，2008年該藥在我國獲得登記。2014年在全球的銷售額達到2.6億美元，在我國也達到億元[26]；截至目前國內已有180項含有五氟磺草胺有效成分的農藥制劑獲得登記[27]，主要用于防治稻田一年生雜草。因ALS不存在于人和哺乳動物中，導致人們不太關注五氟磺草胺對非靶標生物的影響[28]。有研究報道，五氟磺草胺制劑對斑馬魚3月齡幼魚毒性等級中等，且對斑馬魚胚胎和初孵幼魚均有一定的影響[29]；對黃河鯉仔魚、泥鰍幼魚均表現為高毒[30-31]等。與國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)報道的五氟磺草胺原藥對大型溞幼溞毒性等級為低毒，存在差異，而關于五氟磺草胺制劑對溞類毒力研究的報道還很少。因此，有必要探究五氟磺草胺制劑暴露對溞類存活、發育的影響。為進一步開展五氟磺草胺對水生無脊椎動物的生態風險評估提供科學依據。

本文以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑為例，通過急性活動抑制試驗和繁殖試驗，比較其對大型溞和發頭裸腹溞的毒力；并利用TOP-RICE暴露模型和SSD法對其進行風險評估。旨在比較25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對模式生物大型溞與南方常見物種發頭裸腹溞毒力差異，尋找較適合評價南方稻區農藥生態毒理學檢測的指示生物，為農藥環境安全管理提供更可靠的科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗生物

本研究采用的受試大型溞(Daphniamagna)由中國科學院水生生物所提供，實驗室自行保種繁育；發頭裸腹溞(Moinairrasa)采自福建省福州市閩侯縣南通鎮洲頭村小河，經實驗室馴化，純系培養。取一頭健康親溞孤雌生殖3代以上形成室內種群，選取出生24 h內健康、活潑、大小一致的非頭胎健康溞作為實驗材料。大型溞長期穩定地培養于ISO標準稀釋水中，1 L燒杯中飼養20～30頭大型溞，培養溫度(20±2) ℃；發頭裸腹溞長期穩定地培養于M4培養液中，1 L燒杯中飼養50～60頭發頭裸腹溞，培養溫度(25±2) ℃，兩者培養液均每周更換3次，pH 7.0～9.0，光暗比16 h∶8 h，定期投放羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)作為餌料，每天于1 L燒杯中飼喂密度為5.00×105個·mL-1的藻液5～10 mL。

1.2 供試藥劑

五氟磺草胺(化學分子式為C16H14F5N5O5S，CAS號219714-96-2可分散油懸浮劑，陶氏益農農業科技(中國)有限公司生產，有效成分含量25 g·L-1。

1.3 試驗方法1.3.1 急性活動抑制試驗

參照OECD 202標準方法進行48 h急性活動抑制試驗[32]。大型溞設0.19、0.42、0.93、2.05和4.50 mg a.i.·L-15個系列濃度，均用ISO標準稀釋水配制；發頭裸腹溞設4.90×10-2、0.15、4.44、1.33和4.00 mg a.i.·L-15個系列濃度，均用M4培養液配制。并設置不加藥劑的對照，每個處理和對照重復4次，實驗時，在100 mL燒杯中裝入50 mL配制好的不同濃度藥液，每個燒杯中放入5頭幼溞，分別于24 h和48 h后記錄2種溞的中毒癥狀和受抑制數，輕晃試驗燒杯，實驗溞在15 s內不能游動視為活動受抑制。在實驗期間不投喂餌料，不更換試驗溶液。試驗分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h的人工氣候箱內開展。

1.3.2 繁殖試驗

參照OECD 211標準方法中21 d繁殖試驗[33]。根據大型溞急性活動抑制試驗結果，獲得供試農藥對大型溞48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，設3.82×10-4、1.22×10-3、3.91×10-3、1.25×10-2和4.00×10-2mg a.i.·L-15個系列濃度；根據發頭裸腹溞急性活動抑制試驗結果，獲得供試農藥對發頭裸腹溞48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)，設1.91×10-4、3.38×10-4、7.66×10-4、1.53×10-3、3.06×10-3和6.13×10-3mg a.i.·L-16個系列濃度；另設置不加藥劑的對照。每個處理和對照重復10次。試驗時，用量筒量取不同濃度藥液各50 mL，放入100 mL燒杯中，在每個燒杯中放入1頭健康活潑的幼溞，分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h人工氣候箱中連續培養，大型溞試驗時間持續21 d；發頭裸腹溞試驗時間持續到所有受試個體全部死亡。試驗期間采用半靜態試驗系統，每隔1 d更換1次試驗溶液，以保證試驗期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。實驗期間每天記錄2種溞的生存、蛻皮、懷卵和產子情況，及時移出蛻皮和新產幼溞，每天喂食羊角月芽藻。試驗結束時，分別統計平均首次蛻皮時間、首胎時長、平均產幼溞數量和產幼溞胎數、平均存活時間及死亡率等。

1.3.3 供試物真實濃度檢測

在大型溞、發頭裸腹溞急性活動抑制試驗中，于試驗開始0、24和48 h分別取最低濃度組(處理1)、最高濃度組(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學分析檢測室待測供試物的實際濃度；在大型溞繁殖試驗中，所測得新舊溶液為試驗開始0 h、第5天換水前后、第12天換水前后、第19天換水前后、第21天分別取濃度為3.82×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、4.00×10-2mg a.i.·L-1(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學分析檢測室待測供試物的實際濃度；在發頭裸腹溞繁殖試驗中，所測得新舊溶液為試驗開始0 h、第2天換水前后、第6天換水前后、第12天換水前后、第14天分別取1.91×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、6.13×10-3mg a.i.·L-1(處理6)的供試物水樣10 mL送至化學分析檢測室待測供試物的實際濃度。

對于大型溞急性活動抑制試驗水樣的前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，0.19 mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.50 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對于發頭裸腹溞急性活動抑制試驗水樣前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，4.90×10-2mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.00 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對于大型溞繁殖試驗取處理1、處理5水樣；發頭裸腹溞繁殖試驗取處理1、處理6水樣皆用0.22 μm濾膜過濾，上機待測。

五氟磺草胺標準品溶液的配制：稱取99.47%的五氟磺草胺標準品2.50×10-3g，用乙腈定容至25 mL，得濃度為99.470 mg·L-1的母液，將母液用乙腈分別稀釋得到3.00×10-5、1.00×10-4、3.00×10-4、1.00×10-3、2.00×10-3、5.00×10-3、2.00×10-2和5.00×10-2mg·L-1的標準品稀釋液。

添加回收：在對照樣品中添加一定量的乙基多殺菌素標樣溶液，按照水樣檢測條件測定回收率。設1.00×10-4、1.00×10-3和1.00×10-2mg·L-13個添加濃度，每個添加濃度重復5次。

1.3.4 試驗條件與濃度分析

本研究中對于五氟磺草胺在水溶液中的濃度分析采用超高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀(Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S micro)，液相色譜條件：色譜柱為Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=50∶50，流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量2 μL，五氟磺草胺保留時間約為0.95 min。

質譜條件：多離子反應監測(MRM)模式掃描，電噴霧正離子模式(ESI+)，毛細管電壓1.0 kV，錐孔電壓42 V，離子源溫度150 ℃，錐孔反吹氣流量50 L·h-1，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L·h-1，五氟磺草胺定量離子對m/z為 483.97/195.25，定性離子對m/z為483.97/164.23，定量離子碰撞能25 eV，定性離子碰撞能30 eV。

1.4 數據分析

根據溞類急性活動抑制試驗數據，采用SPSS 19.0軟件中的Probit(概率單位法)進行回歸分析，并計算出25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發頭裸腹溞的半效應濃度(EC50)及其95%置信限。根據繁殖試驗數據，采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差(LSD法)分析各種指標的組間差異。采用Excel 2007對各濃度組之間大型溞、發頭裸腹溞死亡率進行數據處理，并用OriginPro 9.1軟件中的Line+symbol功能進行制圖。

1.5 五氟磺草胺對水生生態系統的初級生態效應分析

對五氟磺草胺進行農藥環境風險評估所需要的參數值主要來自農藥性質數據庫(Pesticide Properties Database, PPDB)[34]、EFSA Journal數據庫[35](表1)。通過本研究獲得溞類急、慢性試驗的EC50、無可觀察效應濃度(NOEC)值，并根據相應的不確定因子(UF)，計算出溞類(急性)預測無效應濃度(PNEC=EC50/UF)，溞類(慢性)預測無效應濃度(PNEC=NOEC/UF)。其中，溞類急、慢性不確定因子(UF)分別選擇100和10[36]。

用TOP-RICE模型[13,37]分析得到連平、南昌預測環境濃度峰值(PECmax)中，選取PECmax數值最大的場景進行初級風險評估，根據溞類急、慢性試驗周期，選擇相應的時間加權平均預測環境濃度(PECtwa)作為預測環境濃度(PEC)，分別計算相應的溞類急、慢性風險商值(RQ=PEC/PNEC)。將本試驗計算的RQ與US EPA建立的水生生物關注標準(levels of concerns, LOCS)中RQ等級劃分進行比較。若RQ≤1，表明風險可接受；若RQ>1，表明風險不可接受，則需要進行更高級風險評估。

1.6 五氟磺草胺對水生生態系統的高級生態效應分析

當五氟磺草胺對溞類的初級風險評估不接受時，可收集多個物種的毒性數據采用SSD法進行高級風險評估。通過US EPA的ECOTOX數據庫[38]、高產量物質信息系統(HPVIS)[39]和EFSA Journal[35]數據庫等獲取五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性毒性數據(表2)，對于同一物種有多個數據的情況，采用其所用濃度數據的幾何平均值。采用荷蘭國家公共衛生與環境研究所(National Institute of Public Health and the Environment, RIVM)的RIVM研究小組開發的ETX 2.1模型構建SSD曲線。以SSD計算出的5%物種危害濃度(HC5)，選擇3為不確定因子，計算預測無效應濃度(PNEC=HC5/3)。

通過TOP-RICE模型分析得到連平、南昌預測環境濃度峰值(PECmax)作為預測環境濃度(PEC)，分別計算這2種場景下相應的無脊椎動物風險商值(RQ=PEC/PNEC)。如果RQ≤1，表明風險可接受；RQ>1，表明風險不可接受。

2 結果(Results)

2.1 供試物實測濃度

由表3可知，理論添加濃度≤1.00×10-2，回收率在60%～120%范圍內，說明該方法能夠較為準確地對25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑的含量進行定量。

大型溞、發頭裸腹溞的急性活動抑制試驗中，測得實測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(表4)，其試驗結果符合OECD 202標準[33]規定的試驗要求，說明理論濃度是可重復且穩定的，則以理論濃度計算本試驗結果。

大型溞、發頭裸腹溞的繁殖試驗中，測得實測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(表5和表6)，其試驗結果符合《化學品 大型溞繁殖試驗》(GB/T21828—2008)[40]規定的試驗要求，說明理論濃度是可重復且穩定的，則以理論濃度計算本試驗結果。

表1 TOP-RICE模型所需參數值Table 1 Parameter values for TOP-RICE model

表2 五氟磺草胺對無脊椎動物毒性數據Table 2 Toxicity data of penoxsulam to invertebrates

表3 分析方法準確度試驗結果Table 3 Analysis of the accuracy of the test results

表4 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發頭裸腹溞急性毒性試驗中藥液實測濃度Table 4 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in acute toxicity test to Daphnia magna and Moina irrasa

表5 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞繁殖試驗中藥液實測濃度Table 5 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Daphnia magna

2.2 五氟磺草胺對大型溞和發頭裸腹的急性毒性

25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞和發頭裸腹溞的48 h-EC50分別為0.81 mg a.i.·L-1和0.52 mg a.i.·L-1(表7)。參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》[41]中農藥對溞類的毒性等級劃分標準，該藥對大型溞及發頭裸腹溞的毒性等級皆為高毒。在試驗過程中，對照組的大型溞及發頭裸腹溞死亡率<10%，生長狀況良好；不同濃度處理組的大型溞及發頭裸腹溞在接觸25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑后均受到不同程度抑制，抑制表現狀態為游動不積極、反應遲鈍、沉底。

2.3 五氟磺草胺對溞類的慢性毒性效應2.3.1 五氟磺草胺暴露對大型溞生長發育和繁殖的影響

由表8所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的體長、平均存活個體產幼溞數及蛻皮次數有顯著的影響，隨著濃度提高，大型溞的體長、平均存活個體產幼溞數逐漸縮短或減少。當高于濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1時，大型溞的體長顯著縮短(P<0.05)。當高于濃度3.91×10-3mg a.i.·L-1時，大型溞的產幼溞數顯著減少(P<0.05)。當高于濃度1.25×10-2mg a.i.·L-1時，蛻皮次數顯著降低(P<0.05)。在試驗設定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞首次蛻皮時間、首胎時長、平均存活個體產幼溞胎數影響均不顯著。大型溞產幼溞數隨濃度提高逐漸減少。由圖1可知，前10 d，各濃度與對照中未出現大型溞的死亡；第10天時，僅濃度為1.25×10-2mg a.i.·L-1和4.00×10-2mg a.i.·L-1組開始出現大型溞的死亡；當21 d試驗結束時，對照與濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1組未出現大型溞的死亡，高于濃度1.22×10-3mg a.i.·L-1處理組大型溞死亡率為10%～30%。綜合考慮本研究各項繁殖毒性終點指標，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的繁殖量(平均存活個體產幼溞數)影響作為評價指標，得到大型溞21 d-NOEC值為1.22×10-3mg a.i.·L-1。

2.3.2 五氟磺草胺暴露對發頭裸腹溞生長發育和繁殖的影響

如表9所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發頭裸腹溞的首胎時長、平均存活個體產幼溞數和平均存活個體產幼溞胎數都有顯著的影響，隨著濃度升高，發頭裸腹溞的首胎時長、平均存活個體產幼溞數和平均存活個體產幼溞胎數呈縮短或減少趨勢。當濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時，與3.38×10-4mg a.i.·L-1和1.53×10-3mg a.i.·L-1相比，發頭裸腹溞首胎時長顯著縮短(P<0.05)；當濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時，平均存活個體產幼溞胎數顯著降低(P<0.05)。當高于濃度1.53×10-3mg a.i.·L-1時，平均存活個體產幼溞胎數顯著降低(P<0.05)。在試驗設定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露對發頭裸腹溞首次蛻皮時間、平均存活時間影響不顯著。由圖1可知，前10 d，除對照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中未見到有發頭裸腹溞的死亡，其他各處理組皆存在死亡現象且死亡率較低；第10天時，對照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中開始出現發頭裸腹溞死亡現象，10 d后，隨作用濃度的增加存活率呈下降趨勢，存活時間也隨著濃度的增加而縮短。第14天時，濃度為3.06×10-3mg a.i.·L-1和6.13×10-3mg a.i.·L-1組的死亡率為100%，第16天，對照和其余處理組全部死亡。綜合考慮本研究各項繁殖毒性終點指標，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發頭裸腹溞的繁殖量(平均存活個體產幼溞數)影響作為評價指標，得到14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1。

表6 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發頭裸腹溞繁殖試驗中藥液實測濃度Table 6 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Moina irrasa

表7 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發頭裸腹溞的急性毒性Table 7 Acute toxicity of 25 g·L-1 penoxsulam OD to Daphnia magna and Moina irrasa

2.4 五氟磺草胺對水生生態系統的生態效應分析2.4.1 五氟磺草胺對溞類的初級效應分析

通過TOP-RICE模型分析得到2種不同場景下的五氟磺草胺預測環境濃度峰值和時間加權平均預測環境濃度(表10)。結果顯示，連平-苗期場景與南昌-苗期場景相比，連平-苗期場景的預測環境濃度峰值最高，為8.11 μg·L-1，則選擇該場景下的時間加權平均預測環境濃度(PECtwa)作為預測環境濃度(PEC)，大型溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和4.53 μg·L-1；發頭裸腹溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和5.74 μg·L-1，用于下一步的急、慢性初級暴露分析。本研究獲得的大型溞48 h-EC50為0.81 mg a.i.·L-1，21 d-NOEC為1.22×10-3mg a.i.·L-1；發頭裸腹溞48 h-EC50為0.52 mg a.i.·L-1，14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1，計算出大型溞急、慢性PNEC分別為8.10 μg·L-1和0.12 μg·L-1；發頭裸腹溞急、慢性PNEC分別為5.20 μg·L-1和7.66×10-2μg·L-1。由表11可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞急、慢性的RQ分別為0.88、37.13；對發頭裸腹溞急、慢性的RQ分別為1.38、74.93，故25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞(急性)風險可接受，但對發頭裸腹溞(急性)風險不可接受，且對溞類(慢性)風險不可接受。因此，該藥需要進一步高級效應分析驗證。

表9 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發頭裸腹溞生長發育和繁殖的影響Table 9 Effects of 25 g·L-1 penoxsulam OD on growth and reproduction of Moina irrasa

2.4.2 五氟磺草胺對無脊椎動物的高級效應分析

以TOP-RICE模型分析得到的連平-苗期、南昌-苗期這2種場景下的五氟磺草胺預測環境濃度峰值(PECmax)分別為8.11 μg·L-1和4.00 μg·L-1作為進一步無脊椎動物(急、慢性)高級效應分析的預測環境濃度(PEC)(表10)。通過ECOTOX、HPVIS和EFSA Journal數據庫等獲取五氟磺草胺對8種無脊椎動物毒性數據(表2)，構建了物種敏感性分布曲線，計算出該藥劑對無脊椎動物急、慢性的5%物種危害濃度(HC5)分別為37.89 μg·L-1和3.24 μg·L-1，因此無脊椎動物急、慢性PNEC分別為12.63 μg·L-1和1.08 μg·L-1。由表12可知，在連平-苗期五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性的RQ分別為0.64和7.51；在南昌-苗期五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性的RQ分別0.32和3.70，故五氟磺草胺對無脊椎動物(急性)風險可接受，但對無脊椎動物(慢性)風險不可接受。由圖2可知，同物種的無脊椎動物(急、慢性)對五氟磺草胺的敏感性排序存在明顯差異，大型溞(急、慢性)相對于其他物種而言對五氟磺草胺的敏感性較高。

圖1 25g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露條件下大型溞和發頭裸腹溞的存活率變化注：(a) 大型溞；(b) 發頭裸腹溞。Fig. 1 The survival rate of Daphnia magna and Moina irrasa exposed to 25 g·L-1 penoxsulam ODNote: (a) Daphnia magna; (b) Moina irrasa.

表10 五氟磺草胺初級暴露分析的峰值和時間加權平均濃度Table 10 Environmental exposure concentrations of penoxsulam by junior exposure analysis

3 討論(Discussion)

截至2017年，南方稻區約占我國水稻播種面積的94%，相應地水稻種植期間農藥的大規模使用對農田生態系統的可能風險值得關注[42]。尋找更加適合評價南方稻區農藥生態毒理學的指示生物，為稻田系統精準生態風險評價提供更可靠的科學依據十分重要。在生態毒理學測試中，國際上最常用的無脊椎動物有鉤蝦、大型溞等[43]。大型溞作為一種模式生物，一直被我國廣泛應用，卻忽視了我國幅員遼闊、南北地區地理和氣候差異、水環境中物種分布情況不一致等特點，因此在選擇稻區農藥毒理學檢測指示生物要因地制宜，以便提供更加準確的技術支持。

本研究對發頭裸腹溞試驗采用25 ℃的試驗條件，因有研究表明發頭裸腹溞的最適生殖溫度為25～30 ℃，25 ℃時累積生殖量最大[44]，且水稻生長發育最適溫度為25～30 ℃，綜合考慮采用25 ℃的試驗條件能夠準確體現發頭裸腹溞在自然水環境中受農藥作用后的反應，更符合田間實際情況。通過急性活動抑制試驗結果可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發頭裸腹溞的急性毒性均為高毒，其對發頭裸腹溞的48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)低于對大型溞的48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，表明對同一污染物發頭裸腹溞比大型溞更為敏感。

OECD 211標準[33]方法中規定了大型溞的繁殖試驗為21 d，而對發頭裸腹溞的繁殖試驗未見詳細規定。發頭裸腹溞與大型溞屬于2個溞屬，其生長和繁殖存在差異(表8和表9)。由圖1可知，發頭裸腹溞僅16 d就完成一個世代，其繁殖速度遠快于大型溞，因第15天、第16天存活的母溞數量少且不產溞，故選擇14 d作為發頭裸腹溞試驗周期，其更能反映出發頭裸腹溞在25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露水環境中的整個生長、繁殖周期情況。繁殖試驗結果顯示，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞及發頭裸腹溞的首次蛻殼時間、蛻皮數影響均不顯著，甲殼類動物等正常蛻皮是由蛻皮激素類生長調節劑所誘導，而五氟磺草胺主要是造成合成植物新組織所必需的支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)代謝障礙而致效[21-23]，并未對蛻皮激素起到抑制作用，從而未影響溞的蛻殼時間、蛻皮數。但本研究發現，濃度高于1.25×10-2mg a.i.·L-1時，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的蛻皮數影響顯著，可能是因為試驗過程中大型溞存在死亡現象，導致濃度組的脫殼次數顯著下降。發頭裸腹溞的首胎時長比大型溞短，可能是因為發頭裸腹溞培養溫度高于大型溞。有研究表明，溫度升高可加快枝角類性成熟，從而縮短首胎時長[45]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞首胎時長影響不顯著，卻對發頭裸腹溞首胎時長影響顯著，發頭裸腹溞暴露在1.53×10-3～6.13×10-3mg a.i.·L-1的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑下，首胎時長隨著濃度提高逐漸縮短，可能是由于低劑量農藥刺激性腺發育所致[46]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞平均存活個體產幼溞數影響顯著，但對平均存活個體產幼溞胎數、壽命影響不顯著；對發頭裸腹溞的平均存活個體產幼溞數、平均存活個體產幼溞胎數和首胎時長影響顯著，但對壽命影響不顯著。綜合結果可知，大型溞等溞類的繁殖能力是比壽命更加敏感的評價指標[47-49]，而繁殖能力通常以首胎時長、產胎數和平均存活個體產幼溞數等端點值來考察[47,50]。而25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露作用下，發頭裸腹溞所表現出繁殖能力的敏感性指標比大型溞多。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑雖對大型溞、發頭裸腹溞的平均存活時間影響不顯著，但在本試驗濃度范圍內，隨作用濃度增加發頭裸腹溞存活率逐漸下降，存活時間也隨著濃度的提高而縮短，說明25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對溞類存在慢性致死性(圖1)。如果溞類長期生存在本試驗濃度的自然環境中，其種群數量將受到影響。

表11 五氟磺草胺初級風險評估的風險商值(RQ)(連平-苗期)Table 11 Risk quotient (RQ) of penoxsulam by junior exposure analysis (Lianping-seedling)

表12 五氟磺草胺高級風險評估的風險商值Table 12 Risk quotient of penoxsulam by advanced exposure analysis

圖2 五氟磺草胺暴露下無脊椎動物的物種敏感性分布注：(a) 無脊椎動物急性毒性；(b) 無脊椎動物慢性毒性。Fig. 2 Species sensitivity distribution of invertebrates exposed to penoxsulamNote: (a) Acute toxicity of invertebrates; (b) Chronic toxicity of invertebrates.

本研究經TOP-RICE暴露模型初級評估發現，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的急性風險可接受，但對發頭裸腹溞的急性、對無脊椎動物(慢性)風險不可接受；進一步采用SSD法高級評估可知，五氟磺草胺對無脊椎動物的急性風險可接受，但對無脊椎動物的慢性風險仍然不可接受，表明五氟磺草胺對南方溞種發頭裸腹溞的繁殖水平，即種群規模的發展有潛在生態風險。可能是因為在水田或稻田中，五氟磺草胺主要通過光解作用和生物方式降解[51]，其代謝產物主要有11種，其中有一些代謝物在環境中具有更長的殘留時間，并比母體更難被檢測[52]。Cattaneo等[53]研究發現，鯉魚長時間暴露于含五氟磺草胺的稻田水后，其腦和肝會產生脂質過氧化作用，但在水中卻未檢測到五氟磺草胺，推測可能是緣于五氟磺草胺形成的代謝物。建議在稻田苗期施用五氟磺草胺時應嚴格按照產品說明書的用藥量，切不可過量；應較好地控制水稻在各時期的稻田用水量，以免農藥在土壤中隨水快速下滲遷移，對無脊椎動物產生不良影響。

綜上可知，本研究通過急性活動抑制試驗考察25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對溞類的毒性致死效應，并通過繁殖試驗深入評價其對溞類的毒性強度，結果顯示發頭裸腹溞比大型溞繁殖速度更快、敏感性更高，而從worst-case原則出發，在對廣泛分布于我國南方的稻區進行水環境污染檢測和環境風險評價時，建議采用分布于南方各省并對化學物質更為敏感的發頭裸腹溞作為指示生物，但由于本研究僅采用稻田用量最大的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對模式生物大型溞和南方常見物種發頭裸腹溞進行毒力差異比較，而不同作用機理的農藥品種繁多，該推論可靠性還有待進一步研究，以為今后開展不同氣候帶環境生物安全的精準評價提供科學依據。