寧夏枸杞幼苗葉片中抗氧化酶及游離氨基酸對鎘脅迫的響應

梁昕昕，辛亞平，賈雪，閆興富，魏玉清，趙會君

北方民族大學生物科學與工程學院國家民委生態系統建模及應用重點實驗室，銀川 750021

鎘(cadmium, Cd)是一種毒性較強的重金屬，通過農藥化肥等農藝措施進入土壤，進而向植物體內遷移，不但影響植物的生長發育，而且可以通過食物鏈向人體遷移，影響人體健康。Cd在植物體內的累積會導致植物組織器官的形態改變[1-4]，劉家豪[1]研究發現，隨著Cd濃度的增加，水稻葉肉細胞細胞膜系統被破壞，出現質壁分離等現象；胡炎[2]發現Cd處理下的東南景天莖韌皮部細胞質壁分離，細胞器變形；韓盼盼[3]發現Cd脅迫嚴重破壞了龍葵葉肉細胞的結構，細胞壁斷裂，細胞器受損；李仕友[4]發現Cd脅迫的萬年青葉片組織明顯被破壞。因此，研究Cd脅迫下植物葉片的形態組織變化，可以反映出植物對Cd的耐受適應性。Cd在植物體內的累積誘導產生并累積了大量的活性氧物質，打破了細胞內的氧化還原平衡機制，影響著植物體內的抗氧化酶即過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性[5-7]。楊葉萍等[8]發現Cd脅迫下苧麻體內的SOD、POD與CAT活性增加與Cd的耐受性呈顯著相關，因此研究Cd對植物抗氧化酶活性的影響，有助于揭示植物抗逆生理機制。

逆境環境下，氨基酸也參與了植物的抗逆反應[9-14]，比如甘氨酸(glycine, Gly)能夠增加植物對磷鉀的吸收，提高植物的抗逆性，蘇氨酸(threonine, Thr)和丙氨酸(alanine, Ala)能夠抵抗植物根際病害，脯氨酸(proline, Pro)能調節植物水勢，能引起滲透壓下降，精氨酸(arginine, Arg)具有貯藏氮元素營養的功能[10-12]。近年來的研究發現，氨基酸也參與了植物耐受重金屬的過程，如具有滲透調節能力和重金屬螯合能力的脯氨酸、組氨酸(histidine, His)和植物螯合肽(phytochelatins)，具有清除過氧化物質的谷胱甘肽(glutathione)等與重金屬解毒有重要的關系，有研究表明Cd能夠改變植物體內氨基酸的含量和種類[13-14]，Cd會誘導植物體內脯氨酸大量累積而減輕毒害癥狀，脯氨酸的增加不但可以與重金屬形成脯氨酸螯合物，而且可以保護葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和硝酸還原酶的活性免受鋅(Zn)、Cd的影響，組氨酸能與鎳(Ni)和Zn螯合而降低毒性，還有研究發現組氨酸增加了酵母菌對重金屬的耐受能力[15]，銅(Cu)主要與天冬氨酸(aspartic acid, Asp)和蘇氨酸絡合在一起。半胱氨酸(cysteine, Cys)參與甲硫氨酸(methionine, Met)和谷胱甘肽/植物螯合肽的合成，Cd脅迫能提高擬南芥合成半胱氨酸的能力[16]。

枸杞是寧夏的特色資源植物，但近年來，由于農藥化肥的過度使用以及土壤污染日益嚴重，屢有枸杞及枸杞加工產品中重金屬Cd被檢出或者超標的文獻報道[17-20]；枸杞是寧夏當地重要經濟樹種，也因其優異的抗逆性能，成為鹽堿地及礦區修復的主栽先鋒樹種，因此研究枸杞Cd脅迫下的葉片解剖結構、抗氧化酶的活性變化和游離氨基酸的分配特征，挖掘氨基酸代謝及轉運相關基因的功能，將有助于了解枸杞適應外源性Cd脅迫和對Cd解毒的作用機理。因此本文通過對Cd脅迫下枸杞葉片石蠟切片的觀察、抗氧化酶活性的測定、游離氨基酸組成及分布的檢測和氨基酸轉運蛋白基因表達模式的分析，以期揭示枸杞對Cd耐受的生理及分子機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

選取生長健壯、大小基本一致的寧夏枸杞組培快繁苗，移栽在Hoagland營養液中，置于人工氣候室培養，培養溫度28 ℃，光照時間12 h，濕度60%，每5 d更換一次營養液。待苗子長至10 cm高時，進行后期實驗處理。

1.2 實驗方法1.2.1 枸杞幼苗的處理

經過前期預實驗，以1個月內寧夏枸杞幼苗的生長及生理變化情況為例，100 μmol·L-1的Cd脅迫下，枸杞生理及形態變化明顯而不出現嚴重致死表型，因此本實驗選取生長健康、大小一致的枸杞幼苗54株，分別配制含0 μmol·L-1和100 μmol·L-1CdCl2的Hoagland營養液進行處理，每個處理9株，設置3個重復。

1.2.2 枸杞葉片組織石蠟切片、染色及觀察

選取無Cd處理和Cd處理后第72小時、第144小時的枸杞幼苗的成熟葉片，于FAA固定液中固定過夜，固定后的材料依次置于75%、85%、95%、95%和100%的乙醇中脫水1 h，脫水后的材料經二甲苯溶液透明后浸蠟包埋。蠟塊用石蠟切片機切成厚度約為8 μm的切片，采用番紅-固綠進行二重染色，用中性樹膠封片，具體步驟可參考Deng等[21]的植物石蠟切片技術。

將制成的石蠟切片放在光學顯微鏡下用20×目鏡觀察拍照，并測定葉片柵欄組織細胞長度、海綿組織細胞長度，為了體現實驗的重復性，分別選取3株枸杞幼苗相同部位切片測量每項指標，計算平均值，用Graphpad軟件進行顯著性和方差分析。

1.2.3 枸杞苗葉片中SOD、POD和CAT酶活性的測定

選取長勢均勻一致的水培枸杞苗，在Hoagland營養液中分別設置3種不同濃度梯度的CdCl2(0、100和200 μmol·L-1)，每個處理重復3組，于處理第24小時、第48小時和第72小時取樣，分別稱取每個處理的新鮮成熟葉片各0.5 g，用加入5 mL酶提取液在冰浴研缽中研磨均漿，于4 ℃、11 400 r·min-1離心20 min，吸取的上清液即為酶粗提液。SOD、POD和CAT的活性參考Huang等[22]的方法測定，每個處理重復3次，得到的數據用Graphpad軟件進行顯著性和方差分析。

1.2.4 枸杞幼苗氨基酸含量的測定

枸杞幼苗經0 μmol·L-1和100 μmol·L-1Cd處理72 h后，分別取地上部莖、葉組織，每個處理重復取樣3次，每次重復取3株苗，液氮速凍后用于組織中游離氨基酸含量的測定。

稱取一定量的樣品于EP管中，加入1 000 μL提取液(V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)為2∶2∶1，含400 nmol·L-1內標混合液，-20 ℃)，渦旋30 s混勻并研磨處理，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后取80 μL上清液至LC進樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析，另取上清稀釋10倍后4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取80 μL上清液至LC進樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析，本項目使用Agilent 1290 Infinity Ⅱ series (Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離，液相色譜A相為1%甲酸水溶液，B相為1%甲酸乙腈，柱溫箱溫度為35 ℃，樣品盤設為4 ℃，進樣體積為1 μL，流速0.2～0.4 mL·min-1。所有質譜數據采集及目標化合物定量分析工作，均通過Agilent MassHunter Work Station Software (B.08.00, Agilent Technologies)來完成。

1.2.5 轉錄組測序及氨基酸代謝、合成、轉運相關基因的篩選

選取生長健康、大小一致的枸杞幼苗，以無Cd處理的幼苗為對照，經100 μmol·L-1的Cd處理12 h和48 h后，收集對照和各處理的葉片組織，液氮速凍后用干冰輔助保存運輸到深圳華大公司進行轉錄組測序。所獲得的數據利用GO(Gene Ontology)數據庫和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫進行注釋，重點篩選參與氨基酸合成和轉運、代謝相關的基因并進行實時熒光定量PCR驗證。

1.2.6 實時熒光定量PCR技術分析基因的表達變化模式

1.2.6.1 枸杞組織中RNA的提取及cDNA的合成

取生長大小一致的枸杞幼苗，經100 μmol·L-1的CdCl2處理，于處理后的第0小時、第2小時、第8小時、第12小時、第24小時、第48小時和第72小時取成熟葉片組織，液氮速凍后用于RNA的提取。每0.1 g枸杞組織于液氮中充分研磨后，加入1 mL invitrogen trizol試劑，按照說明書操作步驟提取總RNA，用甲醛變性膠檢測RNA的完整性，取1 μg總RNA經DNaseI (Thermo Fisher Scientific, USA)處理后，用逆轉錄試劑盒(北京全式金)逆轉錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR的模板。

1.2.6.2 實時熒光定量PCR檢測基因表達

為進一步研究氨基酸轉運、代謝相關基因在Cd脅迫下的表達變化情況，篩選了6個相關基因，引物采用primer express 3.0軟件設計，采用美國MX3000pTMqPCR實時熒光定量PCR儀，以寧夏枸杞的β-actin基因作為內參基因[23]，SYBR Green Universal Master mix kit (Toyobo, Osaka, Japan)為熒光染料，模板為稀釋20倍的cDNA，反應體系為20 μL，反應條件為95 ℃、10 min，(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s)，每個基因設置3組重復，45個循環，反應結束后進行溶解曲線分析，所需引物序列如表1所示。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd對枸杞幼苗葉片顯微結構的影響

如圖1所示，與對照相比，隨著Cd處理時間的增加，枸杞葉片上表皮細胞逐漸致密，細胞變小。100 μmol·L-1Cd處理第72小時時，柵欄組織細胞的長度平均在70.93～85.59 μm左右，與對照相比差異達到顯著水平(P<0.0001)；處理第144小時時，柵欄組織細胞的長度平均在51.27～77.41 μm，與對照相比差異達到顯著水平(P<0.0001)。此外，海綿組織的細胞也在變小，100 μmol·L-1Cd處理第72小時時，海綿組織細胞長度大約在64.25～71.88 μm，與對照相比差異不顯著(P>0.05)；處理第144 小時時海綿組織細胞的長度平均在52.92～60.78 μm，與對照相比差異達到顯著水平(P<0.0001)。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Table 1 The primers for qRT-PCR

圖1 不同處理時間下鎘(Cd)對枸杞葉解剖結構的影響注：E表示表皮細胞，P表示柵欄組織，S表示海綿組織；**、***、****表示與對照相比達到顯著水平(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)； (a)未處理的葉片解剖結構圖(×20)，(b)Cd處理72 h的葉片解剖結構圖(×20)，(c)Cd處理144 h的葉片解剖結構圖(×20)， (d)Cd處理后葉片柵欄組織細胞長度，(e) Cd處理后葉片海綿組織細胞長度。Fig. 1 Effects of cadmium (Cd) on anatomical structure of Lycium barbarum L. leaves under different treatment timeNote: E represents epidermis; P represents palisade parenchyma; S represents spongy parenchyma; **denotes P<0.01, ***denotes P<0.001 and ****denotes P<0.0001, compared with the control (CK); (a) Anatomical structure of untreated leaves (×20 magnification); (b) Anatomical structure of leaves treated with Cd for 72 h (×20 magnification); (c) Anatomical structure of leaves treated with Cd for 144 h (×20 magnification); (d) Cell length of palisade tissue of leaves treated with Cd; (e) Cell length of spongy tissue of leaves treated with Cd.

2.2 抗氧化酶活性變化

如圖2所示，隨著Cd脅迫濃度的增加和處理時間的延長，CAT活性呈現上升—下降—上升的趨勢，與對照相比，在第72小時達到顯著水平(P<0.01)；POD活性整體呈現上升趨勢，在受200 μmol·L-1Cd處理的第48小時，與對照組差異已達到顯著水平(P<0.01)；SOD活性在第24小時隨著Cd脅迫濃度的增加有下降的趨勢，但并不顯著，隨著脅迫時間延長呈明顯的上升趨勢，與對照相比差異達到顯著水平(P<0.01)。數據表明在Cd脅迫早期，CAT、POD和SOD參與了枸杞對逆境脅迫的響應。

2.3 Cd脅迫對枸杞不同組織中游離氨基酸含量的影響

如表2所示，與對照相比，經100 μmol·L-1的CdCl2處理72 h后，葉片和莖段中的氨基酸含量發生了一些改變，葉片中氨基丁酸、脯氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和丙氨酸等含量上升，與對照相比，氨基丁酸和脯氨酸含量上升達到顯著水平(P<0.05)，瓜氨酸和丙氨酸含量上升達到顯著水平(P<0.01)，葉片中谷氨酸含量也上升，但不顯著；而部分氨基酸的含量卻顯著下降，如纈氨酸下降達顯著水平(P<0.05)、精氨酸與賴氨酸下降達顯著水平(P<0.001)、絲氨酸下降達顯著水平(P<0.01)；在莖段中，苯丙氨酸、纈氨酸和組氨酸下降達到顯著水平(P<0.01)，甘氨酸、天門冬氨酸和精氨酸下降達到顯著水平(P<0.05)，蘇氨酸和谷氨酰胺下降達到顯著水平(P<0.001)，而脯氨酸的含量卻顯著增加(P<0.01)，在短期脅迫下枸杞不同組織中的氨基酸含量都發生了明顯的改變，說明Cd脅迫影響了枸杞苗體內的氨基酸代謝與合成。

圖2 不同處理時間、不同Cd濃度對枸杞酶活性的影響注：*、**表示與對照相比達到顯著水平(P<0.05、P<0.01)。Fig. 2 Effects of different concentrations of Cd on the enzyme activity of Lycium barbarum L. under different treatment timeNote: *, **denote P<0.05, P<0.01, compared with the control (CK).

表2 氨基酸在莖葉中的含量Table 2 The amino acid contents in leaf and stem tissues (nmol·g-1)

2.4 轉錄組數據中氨基酸代謝、轉運相關基因的篩選及其注釋

以無Cd脅迫的幼苗轉錄組數據為對照，在Cd脅迫第12小時、第48小時的根系和葉片中，分別篩選到了一些參與氨基酸吸收、轉運及合成代謝的相關基因，并利用Mev軟件對這些基因進行了熱圖聚類分析，如圖3、表3和表4所示。在葉片及根系中高效表達的基因主要有部分氨基酸轉運蛋白、氨基酸通透酶、轉氨酶等，而另外一些氨基酸轉運蛋白、轉氨酶和合成酶卻呈現抑制狀態，這可能受氨基酸種類的影響。

2.5 基因的表達模式分析

如圖4所示，AMT基因在Cd脅迫下的第72小時表達量達到顯著水平(P<0.01)，是對照的2.6倍，BAD基因在脅迫第2、12、24和48小時表達倍數達到顯著水平(P<0.05、P<0.01)，GST基因在脅迫的第12小時表達倍數達為對照的40倍，達到顯著水平(P<0.01)；NAT基因表達也受Cd的誘導，在處理第12、48小時達到顯著水平(P<0.001)，分別是對照的10倍和15倍。而PAP基因在脅迫的第8小時為對照的4.5倍，達到顯著水平(P<0.001)，之后表達水平回落，TAT的表達在第8、12和24小時也有所上升，但是表達不顯著。實時熒光定量PCR結果顯示，這些參與氨基酸代謝、轉運與合成的基因，都受到Cd的脅迫而上調表達，參與了Cd脅迫下氨基酸的代謝合成及轉運。

3 討論(Discussion)

近年來，關于植物在Cd脅迫下生長與代謝的研究已成為植物逆境生理學研究的熱點之一。Cd是重金屬，在植物體內的累積量越多，對植物的影響越大[24]。已有研究表明，為了降低脅迫對植物造成的損傷，減少植物體內水分的散失，提高植物的抗脅迫能力，葉片表皮細胞會致密化[25]，葉肉組織細胞也會皺縮[26]。本研究發現隨著Cd脅迫時間的延長，植物葉片的表皮細胞逐漸致密化，柵欄組織細胞與海綿組織細胞不斷縮小，這一結果與劉來[27]的研究發現基本一致，因此我們推測枸杞葉片細胞的縮小與致密化可能會提高枸杞對Cd的耐受性。

表3 葉片中篩選的氨基酸代謝轉運相關基因Table 3 The genes related to amino acid metabolism and transport selected from leaf

表4 根系中篩選的氨基酸代謝轉運相關基因Table 4 The genes related to amino acid metabolism and transport selected form root tissue

重金屬會誘導植物生成大量的活性氧，而抗氧化酶則會清除活性氧，抵抗重金屬對植物的毒害作用[28]，因此在一定程度上抗氧化酶活性的高低可反映植物對重金屬的耐受能力。本研究發現，枸杞中CAT和SOD酶活性在處理第48小時時呈現下降趨勢，有文獻報道，CAT和SOD是金屬酶，Cd在一定程度上會替換金屬酶的金屬離子，導致酶活性下降[29]，但是CAT、SOD和POD總體上呈現上升的趨勢，這一研究結果與李仕友[4]的研究結果較一致，說明Cd脅迫早期，枸杞能保持較高的抗氧化酶活性，從而對Cd脅迫產生一定的耐受性。

有研究表明，嚴重的逆境脅迫會顯著影響植物體內蛋白質的合成與水解系統，即蛋白質會趨向水解，而合成降低。降解后的游離小分子物質或氨基酸在滲透調節、結構保護和代謝調控方面的作用和意義也越來越受到重視[10]。已有大量文獻報道脯氨酸是一種重要的滲透調節物質，植物體內脯氨酸含量的增加與重金屬脅迫有顯著的相關性[12-13]，脯氨酸不但可以調控植物適應由于重金屬脅迫造成的水分缺乏，清除氧化自由基，而且還可以通過調控氣孔關閉來限制重金屬離子的轉移[26-32]。本研究發現，枸杞幼苗的莖葉在受到Cd脅迫后第72小時，脯氨酸均有顯著累積趨勢，暗示脯氨酸在Cd脅迫下可能起到重要的調控作用。根據已有文獻報道可知，外源氨基丁酸的浸泡處理可以顯著性提高植物種子萌發期POD和CAT的活性及發芽指數[33]，也可以促進鹽脅迫下白刺葉片的光合參數[34]，表明氨基丁酸能顯著性提高植物體內POD和CAT活性，增強植物對逆境的適應能力。本實驗結果發現，與對照相比，Cd脅迫誘導了枸杞葉片中氨基丁酸含量顯著增加(P<0.05)，因此推測這可能與葉片對Cd的耐受性相關。丙氨酸在葉片中的含量顯著增加(P<0.01)，由于丙氨酸能增加葉綠素的合成，調節氣孔開放，對逆境有一定的抵抗作用[11]，因此，可能是Cd脅迫下枸杞葉片的一種保護措施。瓜氨酸具有通過一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸生成一氧化氮(NO)的功能，而NO具有減緩逆境脅迫對質膜的傷害，促進脯氨酸的累積，提高抗氧化活性等功能[35]，因此推測葉片中瓜氨酸含量顯著增加間接提高了植物對逆境的適應性，而游離狀態的組氨酸卻在莖稈中顯著下降，究竟是由于組氨酸與重金屬形成絡合物而導致含量下降，還是其他的原因，需要進一步的研究。

逆境脅迫還會引起植物體內氨基酸的分配和轉運，ATF(amino acid transporter family)和APC(amino acid polyamine and choline transporters)家族的基因是目前研究報道的植物氨基酸轉運蛋白。本研究結果充分證實了部分氨基酸轉運蛋白基因(如NAT、TAT、PTS和PAP)對Cd的響應，可能參與了Cd脅迫下相關氨基酸的轉運和分配，氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)是位于細胞膜上與氨基酸轉運有關的載體蛋白，將AAP基因轉入玉米中后能顯著增加玉米籽粒中游離氨基酸含量，提高植物對氮素的利用效率[36]，AAP基因不但在莖葉中高效表達，而且還參與了莖和根的發育[37]，本研究通過熱圖聚類發現，一些氨基酸通透酶的表達量顯著增加，實時熒光定量PCR驗證了PAP基因受Cd調控而上調表達，這些基因的表達，可能會提高Cd脅迫下枸杞對氮素的利用效率。

總之，由于Cd脅迫下枸杞葉片組織細胞的致密與縮小減少了水分子蒸發，保持著較強的抗氧化酶活性、同時在莖葉中大量累積參與Cd解毒和螯合作用的脯氨酸、氨基丁酸、瓜氨酸和丙氨酸等氨基酸來調節地上部對Cd的耐受性，在期間，一些氨基酸通透酶和轉運蛋白，在氨基酸吸收及轉運分配中起到重要作用，這些措施可能是枸杞Cd脅迫下的重要保護機制。