壬基酚在SD大鼠內分泌腺、胃、心臟、肝臟、腎臟和血清的分布與消除

張鈺婕，顏婷，楊警，俞捷，楊雪峰，張建玲，蔣智鋼,#，許潔,*

1. 遵義醫科大學公共衛生學院，遵義 563000 2. 貴州省畢節市織金縣疾病預防控制中心，畢節 551700 3. 遵義醫科大學附屬第二醫院胃腸外科，遵義 563000

壬基酚(nonylphenol, NP)是壬基酚乙氧基酸的降解物，經口暴露是NP的主要暴露途徑[1]，進入人體后能模擬天然雌激素的作用，干擾正常的內分泌功能，還有致癌、致畸和致突變的作用。NP具有脂溶性，能夠在脂肪組織中蓄積。它被廣泛用于制造奶瓶、罐頭盒子及食品包裝袋等的內壁涂層和塑料制品，這些化合物具有較高的親脂性，極易通過食品尤其是脂肪含量高的食品進行遷移，直接影響人體健康[2]。因此研究NP經消化道攝入后的分布與清除具有重要意義。目前已有關于NP清除與分布的研究，Geens等[3]研究發現，NP在人肝臟中濃度最高，其次是腦和脂肪組織。有文獻表明，NP在大西洋鮭魚體內主要排泄途徑是膽汁[4]。曹向可等[5]的結果顯示，雌性大鼠經消化道攝入NP后，在各組織中NP含量為卵巢>子宮>肝>腎>血清。Green等[6]研究發現，經口攝入的NP高達80%被迅速吸收，經肝臟代謝，大多數排泄物在膽汁，24 h排泄基本完成。還有研究發現，SD大鼠經消化道攝入NP后，NP主要分布于實質性器官中，經肝臟清除，食物可以減緩NP的代謝[7]。但是這些研究普遍存在灌胃劑量低、觀察時間短的問題。經查閱文獻和體表面積計算得到NP對大鼠灌胃的半數致死劑量(LD50)約為1 445 mg·kg-1[8]，本課題組前期對大鼠體內NP的研究表明，NP染毒劑量相對較低時也具有生物蓄積性[9]。在上述研究的基礎上綜合考慮，本研究加大NP染毒劑量，約取LD50的3/10 (400 mg·kg-1)作為此次實驗的染毒劑量，并延長觀察時間至120 h，希望能更加全面準確地了解NP在機體內的代謝特征，為進一步研究NP對機體造成的影響以及如何降低NP對機體的影響提供數據依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

液相色譜儀(Agilent公司，Agilent 1100)，色譜柱EclipseXD8-C18(150 mm×460 mm，5 μm)，電子天平(上海精科天平儀器廠，FA2204C)，數顯恒溫水浴鍋(天津泰斯特，DK-98-Ⅱ)，離心機(上海安亭，TDL-S)，旋渦混合器(海門其林貝爾，QL-901)，手持式勻漿機(杭州雷琪實驗器材有限公司，FLUKO，F10)，制冰機(雪科，IMS-30)，正己烷和乙醚(分析純，天津科密歐)，乙腈(色譜純，Dikma Technologies公司)，冰乙酸(色譜純，天津科密歐)，NP標準品(Fluka)，純凈水(怡寶)，NP灌胃試劑(西亞)，玉米油(金龍魚)。

1.2 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠39只，體質量180～240 g，飼養條件為室溫22 ℃，隨機分為13組，每組3只，自由飲水進食，適應性喂養1周，實驗前12 h禁食，只給予飲水。

1.3 色譜條件

流動相為乙腈與0.1%冰乙酸(V(乙腈)∶V(0.1%冰乙酸)=85∶15)，進樣量10 μL，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1，FLD檢測器，激發波長275 nm，發射波長312 nm。

1.4 方法與步驟

將39只大鼠隨機分為13個組，每組3只。除1組作為空白對照組外，其余各組進行一次性400 mg·kg-1NP灌胃(NP溶于玉米油，灌胃體積5 mL·kg-1)，空白對照組按照同等灌胃體積對大鼠進行玉米油灌胃。灌胃后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、92和120 h分別腹腔注射麻醉處死大鼠并摘取其內分泌腺(甲狀腺、胸腺和腎上腺)、胃、肝臟、腎臟和心臟組織及血清保存于-20 ℃冰箱待用。

精確稱取NP標準品，用乙腈溶解稀釋成9、45、90、450、900、1 800、3 600和12 000 ng·mL-1，分別進樣10 μL，用液相色譜儀測定峰面積，以峰面積(Y)對標準濃度(X)繪制標準曲線，得出回歸方程。

NP的提取：(1)分別取大鼠的內分泌腺(甲狀腺、胸腺和腎上腺)、胃、肝臟、腎臟和心臟各0.5 g和血清0.5 mL。(2)將取好的組織0.5 g置于玻璃離心管內，加入正己烷-乙醚提取劑(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，用手持式勻漿機20 000 r·min-1勻漿10 s，4 000 r·min-1離心8 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至進樣瓶上機檢測。(3)將取好的血清0.5 mL，置于玻璃離心管內，加入正己烷-乙醚提取劑(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，置旋渦混合器混勻30 s，靜置15 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至進樣瓶上機檢測。

1.5 數據處理

數據用藥代動力學計算軟件DAS 3.0進行處理。

2 結果(Results)

2.1 NP在胸腺、甲狀腺和腎上腺中的濃度

以峰面積(Y)對標準濃度(X)繪制標準曲線，得出Y=16.38X-55.936，R2=0.9999，標準曲線用于后續NP在各組織的濃度測定。如圖1所示，NP在胸腺中0 h的濃度高于其他腺體，c0=2.006 mg·L-1。攝入后2～4 h吸收速率增大，在第4小時達到峰濃度，cmax=4.927 mg·L-1，是初始濃度的2倍多。最低濃度為1.412 mg·L-1，120 h時濃度為1.803 mg·L-1與初始濃度相差不大。甲狀腺中NP濃度在2 h達到峰值，較胸腺達峰時間早，cmax=3.580 mg·L-1，甲狀腺中NP吸收速度較胸腺快。在0 h腎上腺中NP濃度最低，c0=0.183 mg·L-1。在8 h達到峰濃度，cmax=3.451 mg·L-1，達峰后濃度極速下降變為0.662 mg·L-1(12 h)。

2.2 NP在胃、心臟、肝臟和腎臟中的濃度

如圖2所示，NP在胃內的初始濃度為0.35 mg·L-1，在2 h達到峰濃度且峰濃度很大，cmax=41.4 mg·L-1。在24 h濃度降為2.88 mg·L-1，在120 h濃度降為0.53 mg·L-1。呈現吸收較快，達峰時間短的趨

圖1 壬基酚(NP)暴露后SD大鼠胸腺、腎上腺和 甲狀腺中NP含量-時間關系圖Fig. 1 The content-time relationship diagram for nonylphenol (NP) in SD rat thymus, adrenal gland and thyroid after NP exposure

勢。心臟、肝臟和腎臟中的NP濃度一直都較低，均在4 h達到峰濃度。cmax(心)=2.45 mg·L-1，cmax(肝)=1.41 mg·L-1，cmax(腎)=2.18 mg·L-1。在120 h胃、心臟、肝臟和腎臟內NP濃度趨近于0。

2.3 NP在血清中的濃度

如圖3所示，血清中NP的初始濃度較低，c0=0.263 mg·L-1，在2 h達到峰濃度，cmax=1.931 mg·L-1。2～4 h內濃度直線下降，到4 h濃度下降為1.061 mg·L-1，之后濃度變化為平緩曲線。在120 h時濃度變為0.263 mg·L-1與初始濃度相等。

2.4 NP的代謝動力學

采用藥代動力學軟件DAS3.0處理數據，得出NP在內分泌腺、胃、心臟、肝臟和腎臟中的代謝動力

圖2 NP暴露后SD大鼠胃、心、肝和腎臟中 NP含量-時間關系圖Fig. 2 The content-time relationship diagram for NP in SD rat stomach, heart, liver, kidney after NP exposure

圖3 NP暴露后SD大鼠血清中NP含量-時間關系圖Fig. 3 The content-time relationship diagram for NP in SD rat serum after NP exposure

學參數。NP在各器官中的代謝模型除肝臟符合一室模型外，其余均符合二室模型。NP在大鼠除肝臟外的各組織內消除相半衰期(t1/2β)均為分布相半衰期(t1/2α)的10倍以上。除心臟外，自中央室向外周室轉運速率常數(K12)均大于自外周室向中央室轉運速率常數(K21)(表1和表2)。

2.4.1 NP在內分泌腺及血清中代謝動力學

NP在腎上腺組織中t1/2β=1 306 826.882 h，達峰時間(tmax)=8 h；在胸腺內的曲線下面積(AUC0～t)=251.534 mg·L-1·h最大、平均駐留時間(MRT0～t)=53.901 h最長、中央室總體清除率(CL/F)=0.522 L·kg-1·h-1最小；在甲狀腺內的中央室表觀分布容積(V/F)=66.867 L·kg-1最小、達峰時間為2 h、K12=0.275 h-1、K21=0.165 h-1、MRT0～t=50.705 h；與內分泌腺相比，血清中吸收相半衰期(t1/2Ka)=0.684 h、t1/2α=0.83 h、t1/2β=54.062 h、AUC0～t=68.646 mg·L-1·h、MRT0～t=41.148 h，均最小(表1)。

2.4.2 NP在實質性器官中代謝動力學

NP在胃內的AUC0～∞=364.319 mg·L-1·h最大，MRT0～t=24.822 h卻是最小的；在心臟中，NP的t1/2Ka=2.013 h最長，中央室總體清除率(CL/F)=7.228 L·kg-1·h-1最高，這可能與心臟血流豐富、蓄積的NP較多以及心臟是泵血器官易將物質向外周擴散有關。在肝臟內，NP自中央室消除速率常數(K10)=0.21 h-1較大，K10越大消除越快，即NP在肝臟中消除快。NP在腎臟中的各項代謝動力學參數數值均接近于肝臟。與實質性器官相比，血清中MRT0～t=41.148 h是最長的(表2)。

3 討論(Discussion)

NP是一種類似于雌激素的環境內分泌干擾物，污染嚴重且使用廣泛。研究NP在各組織中的代謝特征，有助于發現NP含量與各組織相關疾病的關系。有文獻稱，血清NP濃度在結直腸癌組顯著高于對照組[9]。據報導，與健康女童樣本相比，性早熟女童樣本血清中的雙酚A(BPA)和4-NP含量明顯偏高[10]。還有研究發現，肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦部疾病風險增加與NP暴露有關[11]。

本研究表明，除心臟外K12均大于K21，說明NP易于從中央室向外周室分布。趙猛等[12]研究得出K21>K12，NP主要分布在血流豐富的組織、器官，這與本研究的結論相反，有待進一步驗證。NP在各組織中的消除相半衰期均較長，認為NP是一種難被清除的環境內分泌干擾物。曲線下面積在胃和胸腺內較大，說明NP在胃和胸腺吸收量較大。然而NP在胃內的平均駐留時間最短，表明NP與胃的親和力較低。NP在腎上腺中的消除相半衰期很長，即消除速度較慢。這可能提示該物質與組織的親和度很高，可以長期甚至終身駐留于體內，而難于在機體正常代謝情況下排出體外。肝臟和腎臟中NP的各項代謝動力學參數數值相近且NP消除較快，推測肝臟和腎臟是NP的代謝器官。有研究稱，NP在肝臟內的代謝是以葡萄糖醛酸化合物的形式完成[13]。在以往的研究中發現，NP在肝臟和腎臟內含量，常常是腎臟大于肝臟[14]或肝臟大于腎臟[5]。而在本次實驗中含量相近，這可能與一次性灌胃的劑量有關。實驗發現，血清中的各項代謝動力學參數數值在所測組織中既不是最高也不是最低，這可能NP與血清親和程度中等有關。總之，NP在胃內分布量大，駐留時間短；在內分泌腺內分布量大，駐留時間長。

本研究通過對39只大鼠一次性灌胃400 mg·kg-1的NP，得到NP在大鼠體內分布與清除的相關數據并總結其代謝特征。但本研究只選用了1個濃度的NP進行一次性灌胃，今后可進行不同濃度梯度的NP一次性灌胃或長期灌胃，并研究它們的分布與清除，以期更加了解NP的代謝規律。

表1 SD大鼠胸腺、腎上腺、甲狀腺及血清中NP代謝動力學參數Table 1 Metabolic kinetic parameters of NP in SD rat thymus, adrenal gland, thyroid and serum

表2 SD大鼠胃、心臟、肝臟、腎臟及血清中NP代謝動力學參數Table 2 Metabolic kinetic parameters of NP in SD rat stomach, heart, liver, kidney and serum