綜合根系活性及葉片光合速率揭示碳納米材料對濕地中水生植物的影響

楊祥宇，鄧亞宏，石益廣，袁小兵，孫志國，何強，陳一,*

1. 重慶大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶大學，重慶 400045 2. 國家低碳和綠色建筑國際研究中心，重慶大學，重慶 400045 3. 重慶大學環(huán)境與生態(tài)學院，重慶 400045 4. 中建三局第二建設工程有限責任公司，武漢 430000

碳納米材料(carbon nanomaterials, CNMs)因其獨特的力學性能、熱持久性和化學穩(wěn)定性而被廣泛應用于眾多領域，如柔性導電復合材料[1]、合金[2]和混凝土[3]等。隨著含有CNMs的商品材料大量合成、使用和處理，CNMs不可避免地被釋放到環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成威脅。污水處理系統(tǒng)作為CNMs進入環(huán)境的必經(jīng)途徑，其受影響情況尚未明確。

人工濕地作為生態(tài)友好型污水處理系統(tǒng)，具有結(jié)構簡單、低能耗、維護方便等優(yōu)點，已經(jīng)越來越得到水處理行業(yè)的認可和推廣[4]。由于生物膜特殊的截留能力及納米顆粒超大的比表面積，雖然人工濕地對常規(guī)氮磷污染物有良好的去除效果，但也被認為是納米級顆粒污染物的重要聚集區(qū)[5-6]。濕地植物作為人工濕地重要的組成部分，它們能直接或間接地去除濕地水體中污染物[7]，例如吸收同化氮、磷養(yǎng)分，富集重金屬，還可有效去除廢水中的有機污染物[8]。此外，濕地植物還可以調(diào)節(jié)pH值，釋放有機分泌物、氧氣，以增強根際微生物對污染物的降解和轉(zhuǎn)化[9]。植物的景觀功能也展現(xiàn)了濕地系統(tǒng)的美學價值。然而，CNMs對濕地植物的生物毒性以及因此對濕地除污效能的影響目前還沒有被充分闡明。

在響應國家“節(jié)能減排”、“創(chuàng)建生態(tài)友好型宜居環(huán)境”政策的大背景下，人工濕地的推廣應用已成為趨勢。為使人工濕地系統(tǒng)更好地服務城鎮(zhèn)廢水處理，在居民環(huán)境中營造更好地景觀氛圍。了解CNMs對水生植物的毒性影響十分必要。盡管之前已有關于CNMs對植物的生理毒性報道，但大多數(shù)CNMs的毒理學研究都在土壤或水培等單一處理基礎上，采用較高劑量對農(nóng)作物或敏感植物進行研究，不適宜說明CNMs在濕地廢水處理這樣的復雜生態(tài)系統(tǒng)中對大型水生植物的影響過程。因此本研究重點考察了3種常見CNMs包括單壁碳納米管(SWCNTs)、多壁碳納米管(MWCNTs)和納米富勒烯(nC60)在人工濕地中對植物生長的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料(Experimental materials)

3種碳納米材料(CNMs)購自江蘇納米先豐(XFNANO)材料科技有限公司。實驗中，SWCNTs和MWCNTs被放置在12 mol·L-1鹽酸溶液浸泡11 h去除殘留金屬催化劑，之后用去離子水清洗直到中性[10]。nC60分散到甲苯中，150 r·min-1振蕩2 h，然后加入4倍體積的去離子水繼續(xù)振蕩，直到甲苯揮發(fā)完全[11]。隨后通過0.22 μm濾膜(ANPEL，上海，中國)。所有洗過的CNMs在60 ℃的烘箱中干燥過夜以得到粉末。

圖1 人工配水中不同碳納米材料(CNMs)的透射電鏡(TEM)圖像和X射線能譜(EDS) 分析結(jié)果(紅色矩形區(qū)域內(nèi)材料的元素分布)注：SWCNTs為單壁碳納米管，MWCNTs為多壁碳納米管，nC60為富勒烯納米材料。Fig. 1 Transmission electron microscopy (TEM) images of different carbon nanomaterials (CNMs) in artificial wastewater and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) analysis results (the area indicated by the red rectangle in TEM images)Note: SWCNTs mean single-wall carbon nanotubes; MWCNTs mean multi-wall carbon nanotubes; nC60 means fullerene.

1.2 實驗設計(Design of experiment)

本研究建立了21個序批次潛流人工濕地(SSF CWs)，水力停留時間(HRT)為5 d，每個濕地的體積為0.045 m3(長0.3 m、寬0.3 m、高0.5 m)。濕地內(nèi)部用礫石(直徑5～8 mm，孔隙度0.4)填充40 cm高，種植香蒲(約20 cm高，種植深度約15 cm，密度約為267 株·m-2)，孔隙體積為12 L。21個反應器共設置4個體系，其中3個濕地為空白組，SWCNTs組、MWCNTs組和nC60組各6個濕地(3個10 μg·L-1濃度處理組，3個1 000 μg·L-1濃度處理組)。所有濕地均置于(25±1) ℃的空調(diào)玻璃溫室內(nèi)。溫室晝夜時間及溫度為18 h/6 h、28 ℃/22 ℃。溫室相對光照度和濕度分別為160 μmol·m-2·s-1和60%。實驗開始前，濕地通入人工配水進行4個月的掛膜啟動過程，以建立穩(wěn)定的生物膜和植物根系。人工配水從濕地頂部的入口倒入，從底部靠重力排出，停留時間為5 d。正式實驗分為短期急性暴露(5 d)和長期慢性累積(180 d)2個階段。

1.3 取樣(Sampling)

植物樣品：植物根系樣品在實驗開始第一批次(5 d)及最后一個批次(180 d)結(jié)束后進行取樣，最大程度取同深度、同粗細的根系5 g，取出后進行酶活性、根系活力及其他項目的檢測。

1.4 根系抗氧化酶活性和丙二醛分析(Analysis of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde in root system)

取1 g鮮根置于預冷研缽，加少量二氧化硅顆粒后冰浴研磨至砂漿狀。加入于5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.0，1 mmol·L-1EDTA和2% PVP)混勻。隨后，將勻漿置于10 mL離心管中，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，分離上清液進行抗氧化酶活性分析[5]。

通過測定超氧化物歧化酶(SOD)抑制硝基藍四唑(NBT)還原能力，確定SOD活性；根據(jù)過氧化氫分解速率確定過氧化氫酶(CAT)活性；通過測定愈創(chuàng)木酚的氧化速率，確定過氧化物酶(POD)的活性；通過測定硫代巴比妥酸反應物質(zhì)(TBARS)的濃度，確定丙二醛(MDA)濃度。所有物質(zhì)濃度均采用分光光度計(DR6000，HACH，日本)進行確定。

1.5 光合作用、根系活力、生物量和元素分析(Photosynthesis, root activity, biomass and elemental analysis)

實驗開始后5 d和180 d，中午10:00—11:00期間，在每個反應器中最大程度選取同高度、同大小、同狀態(tài)的3片葉子利用光合作用儀(LI-COR 6400 XT, Licor, USA)測定凈光合速率，測定過程中保證CO2濃度400 μmol·mol-1和光照度450 μmol·m-2·s-1。根活力測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法確定，具體實驗步驟參考《植物生理學實驗指導》[12]。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS) (iCAP-6300-Duo, Thermo Fisher Scientific, USA)確定植物體內(nèi)磷的含量，180 d后獲濕地植物，清洗根部并分離根葉，直接稱量確定濕質(zhì)量，烘干(75 ℃，3 d)后確定干質(zhì)量，烘干后的根葉分別研磨過篩(60目)后進行消解，消解方法參考文獻[13]。采用元素分析儀(Vario EL Cube, Elementar, Germany)對植物中C、N含量進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理(Statistical analysis)

所有處理組均設置3個平行，結(jié)果以平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示。采用方差分析(ANOVA)檢驗結(jié)果的顯著性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義(SPSS 22.0, IBM).

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 根系活力的改變(Changes of root activity)

根系活力可以直接反映植物根系生長狀態(tài)。如圖2所示，實驗開始5 d后，各組植物根系活力沒有顯著差別；而180 d后，10 μg·L-1和1 000 μg·L-1的CNMs對根系活力產(chǎn)生了顯著影響，分別降低了14.6%和36.8%(P<0.05，SWCNTs組)、7.1%和42.4%(P<0.05，MWCNTs組)、9.9%和11.5%(P<0.05，nC60組)。本研究揭示了CNMs對水生植物根系活力的抑制作用，其影響植物根系生長已有文獻報道。袁剛強等[14]發(fā)現(xiàn)SWCNTs暴露可以顯著降低水稻根長耐性指數(shù)，導致根部生長緩慢。相反，Caas等[15]發(fā)現(xiàn)SWCNTs在水培條件下可以促進洋蔥和黃瓜的根伸長；羅春燕等[16]發(fā)現(xiàn)nC60存在可以緩解菲對水稻根系生長的抑制作用，對植物的根系也有促進作用。關于MWCNTs對植物根系活力的影響，郭敏等[17]發(fā)現(xiàn)水稻幼苗根系活力隨MWCNTs濃度升高而顯著降低，該結(jié)論與本研究相同。根系活力之所以受到抑制，離不開根系細胞活性的改變。為了說明植物細胞活性的改變，本研究對根系酶活性進行了檢測。

圖2 CNMs處理5 d和180 d后濕地植物根系活力的變化注：*表示樣品間有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Root activity of wetland plants under 5 d and 180 d exposure to CNMsNote: *indicates values significantly different from the control over the same exposure period (P<0.05).

2.2 根系酶活性的變化(Changes of enzyme activity in root system)

圖3 植物根系丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性在不同濃度的CNMs及不同暴露時間(5 d和180 d)下的變化注：*表示與對照組相比，處理組樣品有顯著差異(n=3、P<0.05)。Fig. 3 The changes of malondialdehyde (MDA) and antioxidant enzyme activities in roots under different concentrations of CNMs stress after 5 d and 180 d exposureNote: *indicates statistically significant differences (n=3, P<0.05) from the control.

2.3 光合作用速率改變(Changes of photosynthesis rate)

光合作用被認為是植物最重要的功能之一。本研究利用光合作用儀對凈光合速率進行了檢測。如圖4所示，在實驗開始5 d后，各組植物的凈光合作用，除了SWCNTs組有輕微降低外(3.6%～7.0%)，另外2組CNMs處理并沒有顯著變化。在180 d的實驗結(jié)束后，10 μg·L-1和1 000 μg·L-1的3種CNMs處理對凈光合作用均有顯著的抑制作用，分別下降17.5%～52.3%(SWCNTs組)、1.0%～47.7%(MWCNTs組)、3.6%～17.3%(nC60組)。相比之下，SWCNTs的暴露對植物葉片凈光合作用最顯著，其次是MWCNTs，nC60的影響較小。

一般來說，光照度、溫度等外部因素以及還原型輔酶Ⅱ(NADPH)量、Rubisco(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶)濃度等內(nèi)部因素都會影響光合效率[28]。在本研究中，MDA的存在表明，根系細胞膜可能被過氧化物破壞[5]。此外，MDA的產(chǎn)生過剩也會損害光合作用系統(tǒng)中的關鍵功能過程。同樣，Huang等[29]報道，由于過量的ROS存在，水生植物中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)葉綠素含量和光合系統(tǒng)(PSⅡ)功能、活性都會下降。考慮到ROS的存在，電子傳遞速率也隨著抑制強度的增加而降低[30]。關于CNMs對植物光合作用的影響，王李原[31]研究了MWCNTs對蘆薈和蜈蚣草的影響，發(fā)現(xiàn)短時間(24 h)暴露于MWCNTs可以促進植物的光合作用，而長時間(72 h)暴露光合作用則會受到抑制，但并沒有解釋產(chǎn)生機理。對于nC60影響大型水生植物光合作用的研究并不多，但是Tao等[32]和Santos等[33]對柵藻的研究表明，nC60會降低光合產(chǎn)物和葉綠素的含量，最終造成柵藻死亡、浮萍生長受阻。因此，對于本研究中影響葉片凈光合作用程度由大到小依次是SWCNTs>MWCNTs>nC60，與實驗中CNMs誘導MDA產(chǎn)生程度相一致，以此可以推測CNMs誘導植物產(chǎn)生過量MDA是導致葉片凈光合作用下降的關鍵因素。

圖4 CNMs處理5 d和180 d后濕地植物葉片凈光合速率的變化注：*表示與對照組相比，處理組樣品有顯著性差異(n=3、P<0.05)。Fig. 4 Net photosynthetic rate of wetland plants under 5 d and 180 d exposure to CNMsNote: *indicates values significantly different from the control over the same exposure period (n=3, P<0.05).

2.4 生物量的變化(Changes of biomass)

對于CNMs的暴露，植物根葉的響應最終表達在生物量上。經(jīng)過180 d的暴露試驗后，平均每株植物生物量情況，如表1所示。由表1可知，處理組大部分生物量指標含量略低于空白組。尤其值得注意的是，經(jīng)SWCNTs和MWCNTs處理180 d后，植株平均總質(zhì)量低于空白組1%～6%，這樣的削弱趨勢也顯著體現(xiàn)在根干質(zhì)量和葉干質(zhì)量上。而nC60處理組沒有植物生長量低的現(xiàn)象。在本實驗中，對植物體內(nèi)主要元素C、N和P的含量也進行了測定，同時計算了其占植物干質(zhì)量的比例。結(jié)果顯示，與空白組相比，在SWCNTs處理180 d后，C、N和P的百分含量在低、高濃度處理組分別顯著降低8.1%和17.1%、17.8%和50.5%、14.5%和52.6%；MWCNTs處理組中分別降低0.3%和10.5%、21.7%和32.7%、20.1%和45.0%。不同的是，nC60組表現(xiàn)出了低濃度處理提升植物體內(nèi)C、N和P含量(分別升高1.7%、8.0%和5.8%)，而高濃度處理則削減3種元素含量(分別下降3.5%、10.0%和16.6%)。不同組別內(nèi)植物生物量的差異充分反映了3種CNMs在濕地系統(tǒng)中對濕地植物生長狀況的影響。結(jié)合上文提到的根部根系活力、抗氧化酶活性改變以及葉部凈光合作用速率的變化等結(jié)果，并通過分析3種CNMs對植物的作用機理，可認定存在于廢水中的CNMs在濕地系統(tǒng)中長期累積，會顯著改變濕地植物的生長狀態(tài)。植物作為濕地中不可或缺的組成部分，其根系分泌氧分子及微量有機物對根際微生物生理活性具有很好的促進作用，借此間接影響濕地處理效能；同時根系吸收廢水中含N、P元素的營養(yǎng)鹽等，也可以直接影響濕地處理效能。不論是直接還是間接影響，都離不開植物良好的生長狀態(tài)。

2.5 濕地水處理效能變化情況(Changes of treatment efficiency of wetland system)

表1 濕地處理含CNMs人工廢水180 d后濕地植物生物量指標變化Table 1 Changes of plant biomass index in wetland system after treating artificial wastewater containing CNMs for 180 d

表2 不同濃度CNMs處理176～180 d水質(zhì)各指標去除效率變化Table 2 Changes in removal efficiency of each nutrient at 176～180 d after treatment with different concentrations of CNMs (%)

水生植物是人工濕地中不可缺少的組成部分，其健康情況也直接影響人工濕地中營養(yǎng)鹽的去除。CNMs脅迫降低了植物體內(nèi)碳氮磷3種大量元素的百分含量(表1)，這也間接說明CNMs投加導致了植物對碳氮磷養(yǎng)分吸收同化能力的降低，從而削弱了濕地的除污能力。

本研究調(diào)查了香蒲在人工濕地連續(xù)處理含有3種CNMs廢水的短期和長期響應規(guī)律。結(jié)果表明，香蒲急性(5 d)接觸CNMs并沒有顯著的生理活性方面的改變；連續(xù)處理含CNMs廢水180 d(慢性暴露)后，香蒲根系細胞受CNMs脅迫，胞內(nèi)抗氧化酶活性及MDA含量升高，導致根系活力受到顯著抑制，抑制程度由強到弱依次為SWCNTs>MWCNTs>nC60；根部MDA含量增加以及抗氧化酶活性上升，說明CNMs與香蒲根系長期接觸，干擾了根系細胞生理活性，這種干擾在SWCNTs組和MWCNTs組尤為突出，而nC60處理組與空白組比較并沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。同時，本實驗證明，由于根部遭到CNMs的干擾，香蒲地上部葉片的凈光合作用也表現(xiàn)出下降趨勢。暴露于含CNMs的廢水180 d后，由于香蒲生理活性的改變，其生物量嚴重減少，SWCNTs組和MWCNTs組最為顯著，nC60處理組表現(xiàn)為短期輕微促進、長期抑制的結(jié)果。