氮營(yíng)養(yǎng)形態(tài)和Ni2+濃度對(duì)三角褐指藻的影響

楊航，常粟淮，程薛霖，黃旭光,*

1. 閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，漳州 363000 2. 污染控制與監(jiān)測(cè)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000 3. 福建省現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000

近年來，水體的富營(yíng)養(yǎng)化有逐漸加劇的趨勢(shì)，其主要是農(nóng)業(yè)發(fā)展的氮負(fù)荷所引起的。大量氮營(yíng)養(yǎng)鹽排入近海海區(qū)，尤其是尿素(CO(NH2)2)已經(jīng)成為近岸水體中溶解有機(jī)氮庫(kù)的重要組成部分[1-2]。Huang等[3]的研究表明，氮源形態(tài)的不同會(huì)顯著影響浮游植物的生長(zhǎng)和改變浮游植物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變近岸生態(tài)系統(tǒng)，造成一系列的環(huán)境問題。研究表明，近海富營(yíng)養(yǎng)化特別是氮濃度的增加會(huì)影響浮游植物對(duì)微量金屬的吸收，進(jìn)而可能會(huì)影響到金屬在整個(gè)海洋食物鏈中的傳遞[4]。自然界中，鎳(Ni)是一種含量豐富的微量金屬元素。有報(bào)道表明，高濃度的Ni對(duì)人類有致癌性[5]，對(duì)水生生物也有明顯的毒害作用[6]。研究表明一定濃度的Ni對(duì)藻具有毒性作用，例如Ni對(duì)纖維藻的96 h半抑制濃度(EC50)為0.33 μg·mL-1，當(dāng)Ni濃度≥0.40 μg·mL-1時(shí)，纖維藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制，生長(zhǎng)滯期延長(zhǎng)，光合作用受阻[7-8]。浮游植物利用尿素需通過脲酶將其分解成銨氮，而Ni是脲酶的金屬輔基[9]。因此，氮源形態(tài)和Ni濃度必然對(duì)浮游植物的生長(zhǎng)造成影響。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是一種以光合作用理論為基礎(chǔ)，利用體內(nèi)葉綠素作為天然探針，研究和檢測(cè)植物光合生理狀況及各種外界因子對(duì)其影響的新型植物活體測(cè)定和診斷技術(shù)。它具有快速、對(duì)細(xì)胞無損傷和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。正常情況下，植物吸收的光能大部分用來進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，不能被利用的部分則以熱或熒光的形式耗散掉。當(dāng)藻受到脅迫時(shí)，光化學(xué)反應(yīng)效率下降，而熱消耗和葉綠素?zé)晒庠黾樱瑥亩鴮?dǎo)致葉綠素?zé)晒鈪?shù)的改變。因此可以通過葉綠素?zé)晒獾淖兓瘉頇z測(cè)藻受環(huán)境因子的狀況。通過對(duì)各種熒光參數(shù)的分析，可以得到有關(guān)光能利用途徑的信息，也可以反映植物受脅迫的情況[10]。光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ)是類囊體膜中的一種光合作用單位，它含有2個(gè)捕光復(fù)合物和一個(gè)光反應(yīng)中心。PSⅡ的功能是利用從光中吸收的能量將水裂解，并將其釋放的電子傳遞給質(zhì)體醌，同時(shí)通過對(duì)水的氧化在類囊體膜兩側(cè)建立質(zhì)子梯度，ATP合成酶用于產(chǎn)生ATP。轉(zhuǎn)移到質(zhì)體醌的電子最終用于將NADP+還原成NADPH或用于非循環(huán)光合磷酸化。Fv/Fm表示PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，即PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)換效率。Fv/Fm的下降表明，重金屬離子使PSⅡ反應(yīng)中心受損,抑制光合作用的原初反應(yīng)，阻礙光合電子傳遞的過程。rETRmax表示PSⅡ表觀電子傳遞速率，rETRmax的下降表明，重金屬離子使藻類的電子傳遞效率下降[11]。

三角褐指藻(PhaeodactylumtricornutumBohlin)，是海洋中最常見的硅藻種類之一，是海產(chǎn)養(yǎng)殖中的常用餌料，在海洋蝦、貝類的苗種生產(chǎn)中起著重要的作用，同時(shí)也是海洋浮游生物毒性測(cè)試中常用的試驗(yàn)材料。本文擬從浮游植物的生長(zhǎng)和光合作用熒光參數(shù)等方面研究不同氮源形態(tài)下，Ni2+對(duì)浮游植物的作用，探究近海營(yíng)養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)變動(dòng)和重金屬污染對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，并為進(jìn)一步探討其對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)影響積累科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)藻種三角褐指藻來源于廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室。藻種保存在f/2培養(yǎng)基中，光照度為300 μmol·m-2·s-1，光暗周期L/D=14 h/10 h，溫度為(20±1) ℃。

1.2 接種與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用海水取自中國(guó)臺(tái)灣海峽，陳化1 a后使用。實(shí)驗(yàn)用海水經(jīng)0.22 μm醋酸纖維膜過濾，消毒后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)海水中硝酸鹽濃度低于4 μmol·L-1、Ni2+濃度低于0.01 μmol·L-1、尿素濃度未檢出。將實(shí)驗(yàn)藻種于無菌條件下接種到100 mL錐形瓶，于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱(GZP型光照培養(yǎng)箱，廣州康恒儀器有限公司)中饑餓培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)條件：光照度為2 000 lx，光暗周期L/D=14 h/10 h，溫度為20 ℃。

通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置最終Ni2+濃度為0、10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1，以不加Ni2+的空白組為對(duì)照，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，每天定時(shí)搖動(dòng)錐形瓶3次，每次10 s，使浮游植物懸浮。自接種起，每天定時(shí)取樣進(jìn)行葉綠素含量及葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)的測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)共持續(xù)96 h。

1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

采用德國(guó)Walz公司生產(chǎn)的浮游植物熒光儀(Phyto-PAM)進(jìn)行葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)測(cè)定。測(cè)定前，將重金屬Ni2+處理下的三角褐指藻樣品進(jìn)行暗適應(yīng)8 min，然后測(cè)定Fv/Fm和rETRmax等參數(shù)[12]。

1.4 EC50的計(jì)算方法和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

不同時(shí)間(24、48、72和96 h)的Ni2+對(duì)三角褐指藻的EC50計(jì)算，參照Huang等[13]的方法，使用Graphpad Prism8.0計(jì)算得出。軟件利用體內(nèi)葉綠素a熒光參數(shù)(rETRmax和Fv/Fm)和葉綠素a(Chla)含量進(jìn)行主響應(yīng)曲線(PRC)分析，以全面了解不同氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)Ni毒害的影響。反映光合作用產(chǎn)量的Fv/Fm和Chla的劑量效應(yīng)曲線遵循式(1)的3個(gè)參數(shù)對(duì)數(shù)模型。EC曲線呈S形，可測(cè)定EC50的數(shù)值。

(1)

式中：y是響應(yīng)變量(抑制率)，c是Ni2+濃度，d是濃度趨于無窮大時(shí)的響應(yīng)，EC50是導(dǎo)致參數(shù)的50%被抑制的Ni2+濃度，b是比例因數(shù)。

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行多因素連續(xù)測(cè)量方差分析(Ni2+濃度、氮形態(tài)和脅迫時(shí)間)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Ni2+對(duì)三角褐指藻Chl a含量的影響

如圖1所示，以硝酸鈉為氮源時(shí)(圖1(a))，在10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1和10 mg·L-1Ni2+濃度脅迫96 h后，三角褐指藻Chla含量分別為對(duì)照組的106.60%、75.90%、69.40%和52.60%；以尿素為氮源時(shí)(圖1(b))，在10 μg·L-1、100 μg·L-1、1 mg·L-1和10 mg·L-1Ni2+濃度脅迫96 h下，三角褐指藻Chla含量分別為對(duì)照組的117.50%、106.30%、95.90%和62.50%。Ni2+濃度達(dá)到50 mg·L-1時(shí)，處理24 h硝酸鈉為氮源組內(nèi)無Chla檢出，尿素組Chla含量?jī)H為14.10 μg·L-1。統(tǒng)計(jì)分析表明，硝酸鈉為氮源的10 μg·L-1Ni2+處理組，尿素為氮源的10 μg·L-1和100 μg·L-1Ni2+處理組，對(duì)于三角褐指藻Chla含量均呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，Ni2+超過以上濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)的毒性作用顯著(P<0.05)。

2.2 Ni2+對(duì)三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的影響

如圖2所示，2種氮源條件下，濃度為10 μg·L-1～10 mg·L-1Ni2+對(duì)于三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm影響均不顯著(P>0.05)。與各自氮源下的對(duì)照組相比，尿素氮源的10 mg·L-1和50 mg·L-1Ni2+組和硝酸鈉氮源的10 mg·L-1Ni2+處理組，F(xiàn)v/Fm均在24 h下降到最低值，隨后緩慢上升；尿素氮源的100 mg·L-1Ni2+處理組和硝酸鈉氮源的50 mg·L-1和100 mg·L-1Ni2+處理組，F(xiàn)v/Fm均在24 h下降到接近于0，且并未隨著時(shí)間的增加而恢復(fù)。

圖1 不同氮源下Ni2+對(duì)三角褐指藻葉綠素含量(Chl a)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 1 Effects of Ni2 + on chlorophyll (Chl a) content of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

圖2 不同氮源下Ni2+對(duì)三角褐指藻光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 2 Effects of Ni2+ on the light energy conversion efficiency (Fv/Fm) of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

2.3 Ni2+對(duì)三角褐指藻最大電子傳遞速率(rETRmax)的影響

如圖3所示，不同氮源條件下，三角褐指藻rETRmax在Ni2+濃度(10 μg·L-1～1 mg·L-1)處理組中，隨著處理時(shí)間(0～96 h)均無顯著性變化(P>0.05)。不同氮源條件下，三角褐指藻rETRmax在Ni2+濃度10、50和100 mg·L-1處理組中，隨著處理時(shí)間的變化(0～96 h)，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P>0.05)。96 h后，在Ni2+濃度10、50和100 mg·L-1處理組(硝酸鈉為氮源)中，rETRmax分別是對(duì)照組(無添加Ni2+)的63.30%、54.10%和2.90%；同樣處理(尿素為氮源)，rETRmax分別是是對(duì)照組(無添加Ni2+)的60.10%、10.30%和10.50%。

2.4 EC50值

在不同氮源條件下，Ni2+脅迫下三角褐指藻各參數(shù)的EC50變化情況如表1所示。由表1可知，重金屬離子(Ni2+)對(duì)三角褐指藻的EC50值與脅迫時(shí)間以及測(cè)定的參數(shù)有關(guān)。以硝酸鈉和尿素為氮源，三角褐指藻Chla的EC50值從24 h的15.50 mg·L-1和18.42 mg·L-1逐漸下降到96 h的10.02 mg·L-1和11.24 mg·L-1。成對(duì)T檢驗(yàn)表明，以尿素為氮源的三角褐指藻Chla的EC50值高于以硝酸鈉為氮源的(P<0.05)。由表1可知，使用三角褐指藻Fv/Fm和rETRmax計(jì)算EC50值時(shí)，軟件擬合并通過檢驗(yàn)的僅為部分?jǐn)?shù)據(jù)。

圖3 不同氮源下Ni2+對(duì)三角褐指藻最大電子傳遞速率(rETRmax)的影響注：(a)以硝酸鈉為氮源；(b)以尿素為氮源。Fig. 3 Effect of Ni2+ on the maximum electron transfer rate (rETRmax) of P. tricornutum Bohlin under different nitrogen sourcesNote: (a) Sodium nitrate as nitrogen source; (b) Urea as nitrogen source.

表1 不同氮源下Ni2+對(duì)三角褐指藻各參數(shù)的EC50Table 1 EC50 of various parameters of Phaeodactylum tricornutum Bohlin under different nitrogen sources exposed to Ni2+ (mg·L-1)

3 討論(Discussion)

近年來，富營(yíng)養(yǎng)化特別是尿素在海洋環(huán)境中濃度增加已被廣泛關(guān)注。近40年來，尿素作為氮肥的用量在全球范圍內(nèi)已增加了100倍，特別近10年內(nèi)就翻了1倍[14]。大量尿素隨江(河)水進(jìn)入海水，造成近海環(huán)境中尿素濃度逐漸增高。而浮游植物利用尿素必須通過脲酶分解[15-16]。同時(shí)，脲酶的活性離不開Ni作為輔助因子[17]。因此氮營(yíng)養(yǎng)形態(tài)和Ni對(duì)浮游植物的影響，需要進(jìn)一步研究[18]。

Ni是浮游植物生長(zhǎng)必需的微量元素，過量也會(huì)阻礙其生長(zhǎng)發(fā)育[19]。浮游植物對(duì)微量Ni的吸收促進(jìn)了體內(nèi)相關(guān)酶(如超氧化物歧化酶和脲酶等)的合成，促進(jìn)浮游植物的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的Ni2+(10 μg·L-1)處理下，尿素氮源對(duì)Chla濃度的促進(jìn)作用顯著高于硝酸鈉為氮源，而相應(yīng)處理組中的Fv/Fm和rETRmax也表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)，這表明與硝酸鹽濃度相比，低濃度的Ni2+更能促進(jìn)尿素氮源下的三角褐指藻的生長(zhǎng)，這與浮游植物需要攝入微量的Ni(特別是在尿素氮源下)以合成脲酶等含Ni酶有關(guān)[4]。

然而，當(dāng)水體環(huán)境中Ni2+的濃度過高，藻細(xì)胞在代謝過程中被迫吸收環(huán)境的Ni2+，而這些多余的Ni2+并未參與到脲酶等輔基的作用中，細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行細(xì)胞自我保護(hù)，就可能對(duì)藻細(xì)胞構(gòu)成毒性效應(yīng)[20]，進(jìn)而使其光能轉(zhuǎn)化效率、最大電子傳遞效率和葉綠素含量降低。本研究也表明，不論何種氮源下，10～100 mg·L-1Ni2+處理對(duì)三角褐指藻Chla有明顯的毒性作用，并且隨著Ni2+濃度增大、脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，毒性作用越顯著。藻類細(xì)胞壁上帶有負(fù)電荷、羥基和氨基等官能團(tuán)，對(duì)含有正電荷的金屬離子有著較大的親和力，隨著金屬離子濃度的增加，藻細(xì)胞表面的官能團(tuán)與其結(jié)合而喪失活性，從而影響了藻正常的生化反應(yīng)進(jìn)程，最終導(dǎo)致藻的生長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡[21-23]。可見，氮源形態(tài)(尿素和硝酸鈉)和Ni2+濃度均能影響到浮游植物的生長(zhǎng)，且表現(xiàn)出較明顯的差異。

另外，尿素為唯一氮源時(shí)，三角褐指藻Chla的EC50值均高于以硝酸鈉為氮源的，這表明氮源形態(tài)能影響浮游植物對(duì)Ni的耐受性。三角褐指藻在尿素氮源下對(duì)Ni的耐受性強(qiáng)于硝酸鈉氮源。浮游植物在以尿素為唯一氮源時(shí)，需要水體中存在Ni離子[24]，尿素必須通過脲酶水解，生成銨態(tài)氮，然后才能被浮游植物利用。而Ni是脲酶組成的必要輔基，沒有Ni的存在，脲酶無法合成并完成其功能[25]。尿素為氮源時(shí)，浮游植物合成較多的蛋白質(zhì)減低體內(nèi)離子態(tài)Ni的濃度，從而降低其毒性。另外，尿素氮源時(shí)，浮游植物也可能需要較多的Ni參與藻細(xì)胞的生理生化反應(yīng)，因而能耐受比較高濃度的Ni環(huán)境。

三角褐指藻Fv/Fm、rETRmax的EC50值僅有少數(shù)被軟件計(jì)算出并通過檢驗(yàn)，說明藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)隨環(huán)境的變化具有不確定性，而選擇藻類Chla含量的EC50評(píng)價(jià)藻類的金屬耐受性更具可行性。

綜上所述，在尿素和硝酸鈉為氮源下，低濃度Ni2+均能顯著促進(jìn)三角褐指藻的生長(zhǎng)，高濃度的Ni2+對(duì)三角褐指藻都有顯著的毒性效應(yīng)。比較不同氮源下浮游植物Chla的EC50值表明，三角褐指藻在尿素氮源下對(duì)Ni的耐受性強(qiáng)于硝酸鈉氮源，且均隨著時(shí)間的增加而減弱。與Fv/Fm、rETRmax相比，浮游植物的ChlaEC50更適合用于評(píng)價(jià)藻類對(duì)金屬離子毒性和耐受性。