歐前胡素固體分散體的制備及其體內藥動學研究

尚曙玉，張鐵山，徐 凱，范明松

(1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063；2.上海雷允上藥業有限公司技術中心，上海 201401）

歐前胡素是從蛇床、歐前胡、白芷、獨活、當歸等植物中提取出的活性成分［1］,屬于6,7-呋喃香豆素類化合物,具有明顯的抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、擴張血管、鎮痛等作用［2-3］。但該成分水溶性差［4］,藥物溶出度低,從而影響其體內口服吸收的生物利用度［5］(在大鼠體內僅為7.2%［4］)。目前,已有將歐前胡素制成包合物、脂質體的報道［4,6］。

固體分散體是通過溶劑揮發法、熔融法等技術,將難溶性藥物分散于親水性載體中而得到的制劑,可增加溶解度,提高溶出率,促進藥物順利吸收并進入血液循環,從而改善生物利用度或療效［7-12］。因此,本實驗將制備歐前胡素固體分散體,并考察其體內藥動學,以期為該成分或其他難溶性藥物相關劑型的開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ME155DU 型電子分析天平 (瑞士Mettler-Toledo 公司)；UM-1 型超薄磁力攪拌器、US10300D 型超聲儀、UVS-1 小型漩渦混合儀、UGC-12MF 型氮氣吹干儀(北京優晟聯合科技有限公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)；THZ-82 型往返恒溫振蕩器(江蘇金怡儀器科技有限公司)；D8 Advance 型X 射線粉末衍射儀(瑞士Bruker 公司)；螺口帶蓋離心管(南京瑞尼克科技開發有限公司)。

1.2 試劑與藥物 歐前胡素 (批號110826-201812,純 度 98.9%)、異歐前胡 素 (批 號110827-201810,純度98.6%) 對照品(中國食品藥品檢定研究院)。歐前胡素原料藥 (批號1805108-1T,純度＞98%,寶雞辰光生物科技有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K30 (PVP K30,批號25000240379,美國Ashland 公司)；PEG 4000 (批號160302)、PEG 6000 (批號171005) (上海凌峰化學試劑有限公司)；泊洛沙姆188 (批號PJ171105T,江蘇省海安石油化工廠)。

1.3 動物 SD 大鼠,雌雄兼具,體質量約為300 g,購于河南省實驗動物中心,動物生產許可證號SCXK (豫) 2016-0002。

2 方法與結果

2.1 歐前胡素含量測定

2.1.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈-水(55 ∶45)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長300 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取歐前胡素對照品10 mg,溶于50 mL 乙腈中,得到0.2 mg/mL 貯備液,“2.1.1” 項下流動相稀釋至40、10、1.0、0.1、0.05 μg/mL,各6 份,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以歐前胡素質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,得方程為Y=18.028 2X+0.905 8 (r=0.999 8),在0.05～40 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取歐前胡素固體分散體約10 mg,溶于100 mL 稀釋液中,于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得歐前胡素峰面積RSD 為0.82%,表明溶液在48 h內穩定性良好。平行制備6 份供試品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得歐前胡素峰面積RSD 為1.04%,表明該方法重復性良好。取高(40 μg/mL)、中(10 μg/mL)、低(0.05 μg/mL)質量濃度對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得歐前胡素峰面積RSD 分別為0.11%、0.16%、0.12%,表明儀器精密度良好。精密稱取歐前胡素含量已知的供試品溶液,置于100 mL 量瓶中,加入對照品溶液,“2.1.1” 項下流動相稀釋定容至刻度,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定9 次,測得歐前胡素平均加樣回收率分別為100.18%,RSD 為1.53%。

2.2 體外溶出度試驗 采用2020 年版《中國藥典》 四部通則0931 槳法。設置溶出儀溫度、轉速分別為37 ℃、100 r/min,900 mL 0.5% SDS 溶液作為釋放介質,于10、15、20、30、60、90、120 min各取樣3 mL,并立即加入3 mL 空白0.5%SDS 溶液,0.45 μm 微孔濾膜過濾,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定,并計算各時間點累積釋放度。

2.3 歐前胡素固體分散體制備 泊洛沙姆188、PEG 4000、PEG 6000 熔點較低,一般采用熔融法制備固體分散體［13］,而PVP K30 熔點較高,并可溶于無水乙醇等有機溶劑,故本實驗采用溶劑揮發法制備。稱取20 mg 歐前胡素和一定量PVP K30(藥載比1 ∶3、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶9),置于有轉子的圓底燒瓶中,加入30 mL 無水乙醇后置于45 ℃水浴中,持續攪拌3 h 得澄清溶液,45 ℃下減壓旋蒸后得殘留物,置于45 ℃真空干燥箱中過夜,即得PVP K30 歐前胡素固體分散體,研細,過24目篩。

同時,制備PEG 4000 歐前胡素固體分散體。稱取20 mg 歐前胡素和一定量PEG 4000 (藥載比1 ∶3、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶9) 于燒瓶中,在65 ℃水浴中攪拌1.5 h 得熔融液,立即置于-30 ℃超低溫冰箱中保存30 min,置于干燥器中過夜,研細,過24 目篩,即得。同法制備PEG 6000、泊洛沙姆188 歐前胡素固體分散體。

2.4 體外溶出研究 圖1 顯示,PVP K30、泊洛沙姆188、PEG 4000、PEG 6000 歐前胡素固體分散體均可促進藥物溶出,在一定時間內隨著載體比例增加,其溶出率、累積溶出度逐漸升高,以PVP K30 為載體時累積溶出度最高,達94.26%。由于藥載比1 ∶8、1 ∶6 時各時間點累積溶出無明顯差異,故最終選擇PVP K30 作為載體,藥載比為1 ∶6。

2.5 晶型分析 取歐前胡素、PVP K30、物理混合物(藥載比同固體分散體)、固體分散體粉末適量,置于樣品槽中,玻璃片壓平后進行掃描,設置條件為銅靶；管壓40 kV；管流200 mA；掃描速度5°/min；掃描范圍(2θ) 3°～45°,結果見圖2。由此可知,歐前胡素、物理混合物X 射線衍射(XRPD) 圖譜中均有大量晶型衍射峰,但固體分散體中未發現,表明歐前胡素轉變成為無定型狀態。

2.6 表觀溶解度測定 取過量固體分散體、物理混合物、歐前胡素加到蒸餾水中,采用恒溫搖床法在25 ℃下振蕩平衡48 h,靜置1 h 后取上層溶液,0.45 μm 微孔濾膜過濾,取濾液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見表1。由此可知,固體分散體可將歐前胡素的表觀溶解度提高14.39 倍。

圖1 歐前胡素固體分散體溶出曲線Fig.1 Dissolution curves for imperatorin solid dispersions

2.7 體內藥動學研究 參考文獻［14］ 報道。

2.7.1 灌胃液制備 取歐前胡素適量,0.3%CMC-Na 溶液制成4 mg/mL 混懸液；取固體分散體適量,蒸餾水制成含4 mg/mL 歐前胡素的混懸液,即得,臨用現配。

圖2 樣品XRPD 圖譜Fig.2 XRPD patterns for samples

表1 樣品表觀溶解度測定結果（n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of samples （n=3）

2.7.2 分組、給藥與血樣采集 12 只大鼠飼養于溫度25 ℃、相對濕度45%條件下,實驗前1 d 禁食不禁水,隨機分為歐前胡素組和固體分散體組,按25 mg/kg 劑量灌胃給予“2.7.1” 項下相應灌胃液,乙醚麻醉后于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h 眼眶取血各約0.3 mL,置于肝素浸潤離心管中,棉球止血,血樣搖勻后2 500 r/min 離心2 min,吸取上層血漿,置于-20 ℃冰箱中保存。

2.7.3 血漿樣品處理 選擇乙酸乙酯作為提取溶劑,密封備用。取解凍后血漿樣品100 μL,置于螺口帶蓋離心管中,加入內標溶液50 μL、提取溶劑1.5 mL,渦旋5 min 后5 000 r/min離心10 min,分取乙酸乙酯-石油醚層,45 ℃下氮氣吹干得殘渣,加入100 μL 乙腈-水(55 ∶45) 混合液復溶,5 000 r/min 離心10 min 后待測。

2.7.4 線性關系、專屬性考察 稱取10.0 mg 異歐前胡素對照品,溶于100 mL 乙腈中并稀釋至500 ng/mL,即得內標溶液。取“2.1.2” 項下對照品溶液,乙腈稀釋至2 000、1 000、500、250、100、50 ng/mL,分別精密吸取500 μL,45 ℃氮氣吹干后再加入500 μL 空白血漿,即得2 000、1 000、500、250、100、50 ng/mL 血漿對照 品溶液。

量取100 μL 的不同質量濃度血漿對照品溶液,加入50 μL 內標溶液,按“2.7.3” 項下方法處理,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣20 μL 測定。以歐前胡素與內標(異歐前胡素) 峰面積比值為縱坐標(Y),歐前胡素質量濃度為橫坐標(X)進行回歸,得方程為Y=248.33X+14.687 2 (r=0.992 3),在50～2 000 ng/mL 范圍內線性關系良好。

取空白血漿、樣品溶液(加內標)、血漿對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖3。由此可知,歐前胡素、異歐前胡素分別在6.2、7.3 min 出峰,血漿內源性物質不干擾測定,表明該方法專屬性良好。

圖3 歐前胡素HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of imperatorin

2.7.5 方法學考察 血漿樣品在室溫下自然融凍后,于0、2、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得歐前胡素與內標(異歐前胡素) 峰面積比值的RSD 為7.17%,表明溶液在24 h 內穩定性良好。取 低(100 ng/mL)、中(1 000 μg/mL)、高(2 000 μg/mL) 質量濃度血漿對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下各進樣測定3 次,測得其日內、日間精密度RSD 分別小于9.65%、10.85%,表明該方法精密度良好。取上述3 種質量濃度血漿對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得歐前胡素相對回收率為86.06%～93.55%。取不含內標的歐前胡素血漿對照品溶液逐步稀釋,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得定量限(S/N=10)、檢測限(S/N=3) 分別為4、2 ng/mL。

2.7.6 藥動學研究 圖4、表2 顯示,與原料藥比較,固體分散體tmax縮短 (P＜0.05),Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P＜0.01),相對生物利用度增加至2.03 倍,表明固體分散體可促進歐前胡素體內吸收。

圖4 歐前胡素血藥濃度-時間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for imperatorin

表2 歐前胡素主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for imperatorin（， n=6）

表2 歐前胡素主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for imperatorin（， n=6）

注:與歐前胡素比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3 討論

歐前胡素水溶性較低,僅為11.82 μg/mL,會導致其體內溶出受限、口服吸收生物利用度低下,而該成分脂質體的制備工藝較復雜,包封率僅為57.32%［8］。大量研究表明,包合技術可增加藥物溶解度及生物利用度［15］,但包合物對酸不穩定,存在有機溶劑殘留缺陷(包合作用)［16］,而且環糊精包合物在體內會轉化為葡萄糖,對糖尿病患者不利。本實驗采用制備工藝相對簡單的固體分散體技術,可改變歐前胡素存在形式,由結晶型轉化為溶解度更好、溶出速率更快的無定型狀態［17］。

在藥動學研究中,本實驗采用液-液萃取法(乙酸乙酯) 進行血漿樣品處理,方法學考察結果顯示,其回收率較高,并且無干擾。固體分散體組tmax提前,可能與它大大提高了藥物溶出率有關［12］；與原料藥比較,固體分散體Cmax提高了1.96 倍,相對生物利用度提高了2.03 倍,可能與它增加藥物溶解度和溶出度,促進藥物吸收有關。

歐前胡素難以吸收進入血液循環,除了與其本身溶解度較差、難于溶出等原因外,還可能受到胃腸道酶代謝、腸道pH 環境等因素的影響［18-20］,導致藥物發生降解。盡管固體分散體解決了歐前胡素溶解度、溶出度等吸收瓶頸問題［21］,但對該成分在胃腸道穩定性方面的改善作用可能較小,生物利用度的提高程度會受到一定限制,今后將繼續對此加以研究。