延胡索乙素聚乳酸納米粒的制備及其體內藥動學研究

荊 玲，范炎峰，鄒夢夢，劉寬浩

(1.黃河科技學院，河南 鄭州 450063；2.鄭州市第六人民醫院，河南 鄭州 450000）

延胡索乙素是從罌粟科紫堇屬植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 中提取出的生物堿成分［1］,具有鎮痛、降血壓、抗心律失常、抗腫瘤等多種藥理活性［2］。但該成分體內不穩定［3］,體外溶出低,水溶性差,口服吸收的生物利用度不理想(僅為6.59%)［4］,導致臨床應用受限。

隨著人類活動增加及外來物種入侵,延胡索生長環境惡化,進而瀕臨滅絕［5］,故提高該資源使用效率及生物利用度具有重要意義,目前已有將其制成自微乳、脂質體的報道［6-7］。其中,自微乳雖可顯著促進藥物吸收,但處方中需加入大量表面活性劑,具有潛在溶血風險［8］；脂質體雖可保護藥物不被降解,提高藥物體內穩定性、生物利用度,但存在包封率較低、貯存穩定性差等缺點［9］。

聚合物納米粒能有效控制藥物釋放,提高穩定性,改善生物利用度,正日益受到相關學者的關注。聚乳酸作為藥物輔料被收錄進《美國藥典》,是納米給藥系統的載體,與難溶性藥物制成納米粒后可顯著促進后者體內吸收,提高其生物利用度［10-14］。本實驗采用改良的自乳化溶劑擴散法制備延胡索乙素聚乳酸納米粒,對其基本性質、體外溶出進行研究,并考察體內藥動學,以期為相關口服制劑的開發提供依據。

1 材料

AR2240 型電子天平［梅特勒托利多儀器(上海) 有限公司］；U3000 型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；MYP13-2S 型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；JC-220A 型氮氣吹掃儀(浙江創聚環保有限公司)；UVS-1 型渦旋振蕩器(北京優晟聯合科技有限公司)；Millipore 超濾離心管(南京裕成實驗設備有限公司)；TENLIN型實驗室超聲波細胞粉碎機(江蘇天翔儀器有限公司)；Master-sizer 型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

延胡索乙素原料藥 (批號180615,純度98.0%,上海中藥制劑有限公司)；延胡索乙素對照品(批號110726-201604,純度99.2%,中國食品藥品檢定研究院)。聚乳酸(PLA,相對分子質量15 000,批號171013,上海市協泰化工有限責任公司)。透析袋(美國Sigma 公司,分子量8～14 kDa)；泊洛沙姆188 (批號WPE1566D,德國BASF 公司)。SD 大鼠,雌雄兼具,體質量約為300 g,購于河南省實驗動物中心,動物生產許可證號SCXK (豫) 2016-0002。

2 方法與結果

2.1 延胡索乙素聚乳酸納米粒制備 取延胡索乙素30 mg、聚乳酸450 mg,加到30 mL 有機溶劑(乙醇-丙酮比例1 ∶1) 中,超聲溶解,作為有機相；配制泊洛沙姆188 溶液(5 g/L) 80 mL,作為水相,在磁力攪拌下將有機相緩慢滴到水相中,恒溫攪拌15 min 后在40 ℃下減壓旋蒸30 min (每2 min排氣1 次),除去有機溶劑,立即置于冰水混合物中固化15 min,補充水相至80 mL,即得。同法制備不加延胡索乙素的空白納米粒混懸液。

2.2 延胡索乙素含量測定

2.2.1 色譜條件 Thermo C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈-0.1%乙酸(三乙胺調pH 值至6.0)(55 ∶45)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長281 nm；進樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取延胡索乙素聚乳酸納米粒1.0 mL,置于25 mL 量瓶中,丙酮超聲處理2 min,靜置至室溫后流動相定容至刻度,12 500 r/min 離心10 min,取上清液,即得。

2.2.3 線性關系考察 稱取延胡索乙素對照品10 mg,溶于10 mL 乙腈中,得到1 000 μg/mL 貯備液,精密量取2.5 mL,置于50 mL 量瓶中,流動相定容,得到50 μg/mL 對照品溶液,流動相依次稀釋至25.0、12.5、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.2.1” 項色譜條件下各取10 μL 進樣測定。以延胡索乙素質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,得方程為Y=2.108 5X+0.100 9 (r=0.999 7),在0.05～25.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.4 方法學考察 取供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為0.62%,表明溶液在 24 h 內穩定性良好。取 25.0、12.5、0.05 μg/mL對照品溶液,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得延胡索乙素峰面積RSD 分別為0.26%、0.21%、0.38%,表明儀器精密度良好。按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為0.83%,表明該方法重復性良好。精密量取4 mL “2.2.3” 項下貯備液,置于10 mL 量瓶中,乙腈定容,得到400 μg/mL 對照品溶液。取1.0 mL 空白納米粒混懸液,置于25 mL量瓶中,加入上述對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL后丙酮超聲處理2 min,流動相定容至刻度,在“2.2.1” 項色譜條件下各進樣測定6 次,測得延胡索乙素平均加樣回收率分別為99.59%、100.31%、100.05%,RSD 分別為0.64%、0.82%、1.24%。

2.3 包封率、載藥量測定 精密量取1.0 mL 延胡索乙素聚乳酸納米粒混懸液,置于超濾離心管(10 kD) 中,12 500 r/min 離心20 min,取濾液,HPLC 法測定游離延胡索乙素量(m游離)；精密量取延胡索乙素聚乳酸納米粒1.0 mL,置于25 mL量瓶中,丙酮超聲處理2 min,靜置至室溫后流動相定容,12 500 r/min 離心10 min,HPLC 法測定延胡索乙素總量 (m總),計算載藥量、包封率,公式分別為載藥量=［(m總-m游離)/m總脂質］ ×100%、包封率=［(m總-m游離)/m總］ ×100%,其中m總脂質表示納米粒總質量,平行3 份,測定兩者平均值分別為 (76.64 ± 0.23)%、(5.01 ±0.12)%。

2.4 延胡索乙素聚乳酸納米粒表征

2.4.1 Zeta 電位、粒徑 取延胡索乙素聚乳酸納米粒混懸液100 μL,置于2 mL 蒸餾水中,測定其Zeta 電位、粒徑,結果見圖1～2。由此可知,3 批納米粒平均Zeta 電位為(-11.1±1.5) mV,粒徑為(176.18±5.21) nm,PDI 為0.081±0.011。

圖1 延胡索乙素聚乳酸納米粒Zeta 電位Fig.1 Zeta potential of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

圖2 延胡索乙素聚乳酸納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.4.2 形態 取適量延胡索乙素聚乳酸納米粒混懸液,滴加至碳膜的銅網上,1.0% 磷鎢酸染色,干燥后置于透射電鏡(TEM) 下觀察其形態,結果見圖3。由此可知,納米粒粒徑與粒度分析儀測定結果基本一致,它基本呈球形,之間無粘連。

圖3 延胡索乙素聚乳酸納米粒TEM 圖Fig.3 TEM image for tetrahydropalmatine polylactic acid nanoparticles

2.5 凍干粉制備及表征 取3 mL 延胡索乙素聚乳酸納米粒混懸液,置于西林瓶中,加入3%甘露醇作為凍干保護劑,振蕩混勻,置于-55 ℃冷凍干燥機中預凍48 h 后抽真空,6 h 內升溫至-20 ℃后保持12 h,3 h 內升溫至0 ℃后保持2 h,3 h 內升溫至25 ℃后保持12 h,即得,密封。凍干粉復溶后,測得其平均粒徑為(226.91±7.81) nm,Zeta 電位為(-7.5±1.2) mV,包封率下降至 (70.14±1.02)%,載藥量為(4.23±0.23)%。

2.6 體外釋藥研究 取適量延胡索乙素聚乳酸納米粒凍干粉末(含延胡索乙素20 mg),加入3 mL 1.0%SDS 溶液制成釋放液,置于透析袋(分子量8 000～12 000 Da) 中,尼龍繩兩端扎緊。以900 mL 1.0%SDS 溶液為釋放介質,設置溶出儀溫度為37 ℃,轉速為100 r/min,于0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h 各取樣3 mL,同時補加3 mL 1.0%SDS 溶液,另取適量延胡索乙素混懸液(分散于1.0% SDS 溶液中) 置于透析袋中,含藥量均為20 mg,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖4。由此可知,原料藥釋放非常緩慢,12 h 內累積釋放度僅為26.39%,12～36 h 內幾乎無釋放,可能與延胡索乙素水溶性差、藥物顆粒較大有關；聚乳酸納米粒在各時間點的累積釋放度均高于原料藥,體外釋藥與Weibull 模型擬合度最高(r=0.988 4),見表1。

圖4 延胡索乙素體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curves for tetrahydropalmatine

表1 模型擬合結果Tab.1 Results of model fitting

2.7 體內藥動學研究

2.7.1 分組、給藥與采血 12 只大鼠隨機分為2 組,每組6 只,給藥12 h 前禁食不禁水,按20 mg/kg劑量分別灌胃給予延胡索乙素0.5%CMCNa 混懸液(2.0 mg/mL)、延胡索乙素聚乳酸納米粒凍干粉溶液(2.0 mg/mL)。乙醚麻醉大鼠后,于0、0.25、0.5、1、2.0、2.5、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各約0.3 mL,3 000 r/min 離心2 min,血漿樣品置于-20 ℃冰箱中保存。

2.7.2 血漿樣品預處理 吸取大鼠血漿100 μL,置于10 mL 具塞玻璃離心管中,加入1 mol/L NaOH 溶液50 μL,渦旋2 min,加入4.0 mL 乙醚繼續渦旋3 min,3 000 r/min 離心15 min,取上層有機相,氮氣緩慢吹干,100 μL 乙腈復溶,3 000 r/min 離 心5 min,取20 μL 上清液,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.7.3 線性關系考察 制備2 000 ng/mL 對照品溶液,乙腈依次稀釋至1 000、500、250、100、25 ng/mL,分別精密量取500 μL,35 ℃氮氣緩慢吹除有機溶劑,加入500 μL 空白血漿,渦旋5 min,得到25、100、250、500、1 000、2 000 ng/mL血漿對照品溶液,按 “2.7.2” 項下方法處理后在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以延胡索乙素質量濃度為橫坐標(X),峰面積縱坐標(Y) 進行回歸,得方程為Y=0.206 9X+0.071 3 (r=0.993 8),在25～2 000 ng/mL 范圍內線性關系良好。

2.7.4 方法學考察取 “2.7.3” 項下25、1 000、2 000 ng/mL 血漿對照品溶液,在“2.2.1”項色譜條件下各進樣測定6 次,測得延胡索乙素峰面積RSD 分別為10.88%、7.03%、5.92%,表明儀器精密度良好。取上述3 種質量濃度的血漿對照品溶液,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,將測定含量與實際含量比較,測得延胡索乙素加樣回收率在86.47%～92.72%之間,RSD 分別為6.38%、7.16%、5.06%。取血漿樣品適量,于0、1、2、3、4、5 h 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得延胡索乙素峰面積RSD 為3.54%,表明樣品在5 h 內穩定性良好。取“2.7.3” 項下25 ng/mL血漿對照品溶液,逐步稀釋后在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得定量限(S/N=10)、檢測限(S/N=3) 分別為5、2 ng/mL。

2.7.5 結果分析 圖5、表2 顯示,與原料藥比較,聚乳酸納米粒tmax、t1/2延長(P＜0.05,P＜0.01),Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P＜0.01),相對生物利用度增加至2.41 倍。

圖5 延胡索乙素血藥濃度-時間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for tetrahydropalmatine

表2 延胡索乙素主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

表2 延胡索乙素主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for tetrahydropalmatine （， n=6）

注:與延胡索乙素比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

3 討論

在制備難溶性藥物納米給藥系統(如固體脂質納米粒、納米結構脂質載體、納米混懸劑等)時,一般需借助高壓均質機、超聲儀等設備［4-5］,而且常使用二氯甲烷等有毒試劑［14］,導致其推廣應用受到限制。本實驗采用改良的溶劑擴散法制備延胡索乙素聚乳酸納米粒,可避免使用有毒試劑或高能設備,具有一定的應用價值。

延胡索乙素生物利用度較低,可能與其體內不穩定［3］、體外溶出低、水溶性差［4］等因素有關。本實驗中體外溶出結果顯示,延胡索乙素聚乳酸納米粒在各個時間點的累積溶出度均高于原料藥混懸液；體內藥動學結果顯示,延胡索乙素聚乳酸納米粒tmax顯著延后,可能是由于其粒徑較小,口服后容易吸附在腸壁,甚至進入絨毛間隙,增加滯留時間,從而延緩吸收［15-16］。同時,延胡索乙素半衰期顯著延長,體內消除速度變慢,循環時間變長,其原因一方面可能是納米粒改善了藥物可潤濕性；另一方面,泊洛沙姆188 吸附在納米粒表面,在增加潤濕性的同時也產生了空間位阻效應,可減少單核吞噬系統的吞噬,最終降低體內消除速度。另外,該成分相對生物利用度提高至2.41 倍,可能是由于(1) 納米載體聚乳酸包裹藥物后,有助于提高藥物體內穩定性［15-18］；(2) 消除半衰期顯著延長,增加藥物體內循環時間；(3) 納米級別的藥物更容易通過腸道peyer’s patch 結進入血液循環,最終提高生物利用度［19］。今后,本實驗將著重于延胡索乙素聚乳酸納米粒藥效學方面的考察［20-22］,以期為相關研究提供更為全面的資料。