一測多評法同時測定4 種中藥注射液中9 種丹參酚酸

陳 影，吳 婷，姜 超，襲曉昀，張 倩，戴國梁，許美娟，居文政

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖,能活血祛瘀,主要用于治療胸痹心痛,其有效成分有水溶性、脂溶性兩類,前者主要包括丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸D 等。研究表明,丹參酚酸具有改善微循環［1］、抑制血小板聚集［2］、抗氧化［3］、增加冠脈流量［4］和心肌供氧量［5］等藥理作用。

由于丹參水溶性成分的活血祛瘀功效良好,而且注射液起效迅速,療效顯著,故市場上出現多種含丹參水提物的中藥注射液,但2020 年版《中國藥典》 僅以丹酚酸B、迷迭香酸為其水溶性成分檢測指標,難以保障丹參內在質量,具有一定的局限性；多指標質量控制模式需要較多種類的標準品,而且有一部分價格昂貴,穩定性差。

王智民［6］等提出利用一種相對易得、廉價的內參來實現多種成分同時測定的一測多評法,被認為適合于中藥多指標質量控制與評價模式,已廣泛應用于中藥材［7-8］及中藥制劑［9-10］的研究。目前,已有文獻報道指紋圖譜、一測多評等方法在含丹參制劑質量評價中的應用［11-12］,但尚未涉及丹酚酸E、丹酚酸D。因此,本實驗采用一測多評法同時測定丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,以期為上述中藥注射液的質量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Waters e2695 型高效液相色譜儀 (美國Waters 公司)；Milli-Q Advantage A10 型超純水機(美國Millipore 公司)；KH5200E 型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；CPA225D 型電子天平(德國Sartorius 公司)。

丹參素鈉(批號180302-014)、紫草酸(批號180724-028)、原兒茶醛(批號13021902) 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸E (批號DST190507-065) 對照品購于成都德思特生物技術有限公司；丹酚酸D (批號12122305)、迷迭香酸(批號16040512)、丹酚酸B (批號13020104)、丹酚酸A (批號13020701) 對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司,純度均大于98%。丹參注射液購自正大青春寶藥業有限公司(批號1901183、1811203、1711052)；丹紅注射液購自山東丹紅制藥有限公司(批號19031017、17091018)；冠心寧注射液購自亞寶藥業集團股份有限公司 (批號181101)；香丹注射液購自國藥宜賓制藥有限公司(批號18100412)；維生素C 注射液購自華潤雙鶴利民有限公司(批號19040213)。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～8 min,5%～13%A；8～14 min,13%～15% A；14～17 min,15%～23%A；17～22 min,23%～25% A；22～27 min,25%～27% A；27～30 min,27%～35% A；30～34 min,35%～5%A；34～38 min,5%A)；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長285 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 對照品適量,50%甲醇制成質量濃度分別為3.97、3.50、1.00、3.82、1.32、5.02、3.53、3.44、1.00 mg/mL,即得。

2.2.2 供試品溶液 取丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液適量,50% 甲醇稀釋10 倍,并加入適量維生素C 注射液,12 000 r/min離心10 min,取上清,即得(含0.1%維生素C)。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗及峰純度檢測 取對照品、供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖1。由此可知,各成分基本達到基線分離,分離度均大于1.5,理論塔板數以各成分計,均不低于5 000。同時,采用光電二極管陣列檢測器對各成分進行紫外光譜掃描和峰純度檢測,發現除咖啡酸、丹酚酸E 含量低于定量下限外,其余成分紫外吸收光譜與相應對照品基本一致；除丹紅注射液、香丹注射液中咖啡酸因含量過低,峰純度因子低于900 外,其余成分均大于980。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液適量,制成6 個質量濃度,在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,并分別以S/N=3、S/N=10 為檢測限、定量限,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取對照品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次,測得丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 峰面積RSD 分別為0.90%、0.83%、0.86%、0.65%、0.73%、0.81%、0.88%、0.67%、0.82%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取丹參注射液 (批號1901183)、丹紅注射液(批號19031017)、冠心寧注射液 (批號181101)、香丹注射液 (批號18100412),按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得各成分峰面積RSD 均≤2.15%,表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取丹參注射液 (批號1901183)、丹紅注射液(批號19031017)、冠心寧注射液 (批號181101)、香丹注射液 (批號18100412),按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,于 0、6、12、18、24、30、36、48 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得各成分峰面積RSD 均分別小于等于2.59%、2.34%、3.18%、2.71%、2.19%、2.51%、2.15%、2.95%、2.11%,表明溶液在48 h 內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的丹參注射液 (批號1901183)、丹紅注射液(批號19031017)、冠心寧注射液(批號181101)、香丹注射液(批號18100412),精密加入適量對照品溶液,按“2.2.2” 項下方法各平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率。結果,丹參素平均加樣回收率95.63%～101.62%,RSD≤2.92%；原兒茶醛平均加樣回收率94.48%～106.08%,RSD ≤3.42%；咖啡酸(僅在丹參注射液、冠心寧注射液中) 平均加樣回收率100.13%～109.07%,RSD≤5.61%；丹酚酸D平均加樣回收率96.60%～101.82%,RSD≤2.93%；迷迭香酸平均加樣回收率96.17%～102.29%,RSD≤2.66%；紫草酸平均加樣回收率99.51%～102.57%,RSD≤4.89%；丹酚酸B 平均加樣回收率95.21%～103.81%,RSD≤2.96%；丹酚酸E (僅在丹參注射液、香丹注射液中) 平均加樣回收率90.37%～102.23%,RSD≤4.10%；丹酚酸A 平均加樣回收率95.09%～102.41%,RSD≤5.16%。

2.4 相對校正因子測定 吸取“2.3.2” 項下對照品溶液適量,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,以原兒茶醛為內標,分別采用斜率法、多點校正法計算其他8 種成分相對校正因子fk/s,公式為fk/s=fk/fs=(CkAs)/ (CsAk),其中Ck為其他成分含量,Ak為其他成分峰面積,Cs為內標含量,As為內標峰面積,結果見表2,可知2 種方法所得結果接近［相對誤差(RE) ≤1.72%］。

2.5 耐用性考察

2.5.1 儀器、色譜柱 本實驗考察了Waters 2695、Agilent 1100 色譜儀,以及Agilent ZORBAX SB-C18、Waters Symmetry C18、Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 對相對校正因子的影響,結果見表3,可知均無明顯影響(RSD≤4.75%)。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 進樣體積、體積流量、柱溫 本實驗采用Waters 2695 色譜儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱,考察進樣體積5、10、20 μL,體積流量0.8、1.0 mL/min,柱溫25、30、35 ℃對相對校正因子的影響,結果見表4,可知均無明顯影響(RSD≤1.40%)。

表4 不同進樣體積、體積流量、柱溫對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different injection volumes，volumetric flow rates and column temperatures on relative correction factors

2.6 色譜峰定位 吸取“2.2.1” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,考察“2.5.1” 項下色譜儀、色譜柱對相對保留時間的影響,結果見表5,可知均無明顯影響(RSD≤3.17%)。

表5 不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.7 樣品含量測定 取3 批丹參注射液、2 批丹紅注射液、1 批冠心寧注射液、1 批香丹注射液,按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下進樣測定,分別采用外標法、一測多評法計算含量,結果見表6,可知2 種方法所得結果接近(RE≤4.78%)。

表6 各成分含量測定結果Tab.6 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實驗中有機相考察了乙腈、甲醇及其混合液,水相考察了甲酸、磷酸,發現以乙腈-0.1%磷酸洗脫時各成分色譜峰峰形良好,出峰時間早,基線平穩,故選擇其作為流動相。前期關于丹酚酸類成分一測多評的文獻中,柱長大多為250 mm［13］。又因在本方法下,待測色譜峰分離度良好,用時較短,故選擇柱長為150 mm,可為丹參制劑的質量控制提供更多參考。

3.2 抗氧化劑選擇 梁文儀［14］等報道,丹酚酸A在抗氧化、抗心肌缺血/再灌注方面均有明顯藥理活性,但該成分不穩定［15］,許多研究也不測定它在丹參制劑中的含量［16］。為更好地體現含丹參成分中藥注射液的內在質量,本實驗擬添加抗氧化劑以增強丹酚酸A 穩定性,參考文獻［17-18］ 確定為維生素C,并考察了含0～0.5%該成分的丹參注射液在48 h 內的穩定性,發現其含量在不加維生素C 時于6 h 內減少了79%,而加入0.1%維生素C 后于48 h 內僅降低3.2%。

3.3 內標選擇 由于原兒茶醛穩定性好,響應值高,而且價廉易得,故選擇其作為內標［19］。另外,不同高效液相色譜儀對丹參素的響應差別較其他成分大［20］,應予以關注。

4 結論

本實驗建立的一測多評法可同時測定丹參注射液、丹紅注射液、冠心寧注射液、香丹注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸E、丹酚酸A 的含量,結果準確可靠。同時,該方法也可應用于丹參水溶性成分的質量控制,從而為全面評價該系列制劑的質量提供參考。