20（S）-原人參二醇止血作用及其機制

宿文杰，張玉堯，李榮森，王隸書，2，徐云鳳，張 鶴，4*

(1.長春中醫藥大學/吉林省中藥生物大分子重點實驗室，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 130012；3.長春金賽藥業股份有限公司，吉林 長春 130012；4.長春中醫院大學附屬醫院，吉林 長春 130021）

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) FH.Chen 的干燥根,對血液系統有止血、抗血栓雙重作用。目前,三七中抗血栓類皂苷成分研究報道較多,其中原人參二醇型人參皂苷Rb1［1］、Rg3［2］、Rd 和Rh2［3］,原人參三醇型人參皂苷Re［4］、Rg1［5］、Rg2［6］,三七皂苷Fc［7］和R1［8］均可抑制血小板聚集和抗血栓形成。而三七中的止血成分主要是三七素［9-10］；三七皂苷Ft1 也有一定的止血功效［3,11］。在目前的研究中發現,三七中三七素質量分數僅為0.76%［12］,三七皂苷Ft1更低,故認為三七中重要的止血成分仍未被發現。20 (S) -原人參二醇型皂苷在酸、堿、酶、微生物等條件下可水解脫去糖鏈,得到20 (S) -原人參二醇皂苷元 ［20 (S) -protopanaxadiol,PPD］［13-14］。近年來,研究發現PPD 能夠通過升高抑郁模型大鼠腦內的去甲腎上腺素(NA)、HAV和5-羥色胺 (5-HT) 水平,發揮抗抑郁的作用［15］。而NA 和5-HT 水平升高可激活血小板,促進血小板聚集［16-17］,Gao 等人報道PPD 能增加ADP 誘導的血小板聚集率［3］。目前尚未有PPD 在止血方面研究,因此本實驗主要研究PPD 的止血作用并初步探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性昆明小鼠(18～22 g) 和雄性Wistar 大鼠(180～200 g) 購自遼寧長生生物技術有限公司,動物生產許可證號SCXK (吉) -2016-0003。實驗經長春中醫藥大學實驗動物倫理學委員會批準(編號20170903),動物飼養于SPF 級飼養室內,12 h/12 h 晝夜循環,室溫(22±2)℃,相對濕度50%～55%,自由攝食飲水,實驗開始前適應性飼養3 d。

1.1.2 試劑與儀器 20 (S) -原人參二醇(純度≥98%,批號MUST-16070401,上海源葉生物科技有限公司)；注射用白眉蛇毒血凝酶(Hemocoagulase,批號170622,錦州奧鴻藥業有限責任公司)；凝血酶原(PT,批號20181226)、活化部分凝血活酶時間 (APTT,批號20181226)、凝血酶時間(TT,批號20181226)、纖維蛋白原(FIB,批號20181226) 試劑盒(南京建成生物工程研究所)；螢光素/螢光素酶試劑和凝血酶(美國Chrono-Log公司)；Fluo 3-AM (批號S1056,碧云天生物技術研究所)；環磷酸腺苷 (cAMP) ELISA 試劑盒(批號20181009A)、環磷酸鳥苷(cGMP) ELISA試劑盒(批號20 181 009 A) (上海優選生物科技有限公司)；PAC-1 (批號304904)、CD62P (批號362804) (美國BioLegend 公司)。自動凝血分析儀(江蘇霍納醫療器械有限公司)；XT-2000i 自動血液分析儀(日本希森美康株式會社)；700 型血小板聚集儀 (美國Chrono-log 公司)；Infinite M200Pro 多功能酶標儀 (瑞士 Tecan 公司)；Cytation 5 多功能酶標儀(美國Bio-Tek 公司)；流式細胞分析儀(美國BD 公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠斷尾和肝劃痕出血時間測定 小鼠斷尾模型,取雄性昆明小鼠(18～22 g) 40 只,隨機分為5 組,分別為空白對照組(1% CMC-Na 生理鹽水),血凝酶組 (1 kU/L),低、中、高劑量PPD 組(2、4、8 mg/kg)。皮下給藥4 h 后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠。5 min 后,固定于鼠板,將鼠尾置于37 ℃生理鹽水中預溫3 min,距鼠尾尖端10 mm 處用干凈手術刀剪斷,尾巴浸沒37 ℃的生理鹽水中,記錄出血時間。出血時間是從剪斷開始出血到停止出血的時間。

小鼠肝劃痕模型,分組給藥方式與小鼠斷尾模型相同,麻醉5 min 后,固定于鼠板,用干凈的手術剪刀沿腹正中線剪開腹腔,暴露肝臟。保持小鼠生命,用2 mL 注射器形成約1 cm 創口,造成肝臟出血,用濾紙片每隔10 s 蘸一下,直至濾紙上沒有血跡為停止出血,記錄出血時間。每個實驗結束后,二氧化碳安樂死法處死動物。

1.2.2 大鼠血常規的檢測 將40 只Wistar 雄性大鼠(180～200 g) 隨機分為5 組,空白對照組(1% CMCNa 生理鹽水),血凝酶組(1 KU/mL),低、中、高劑量PPD 組(2、4、8 mg/kg)。皮下注射藥物4 h 后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血,加入到含有EDTA 的抗凝管中。應用XT-2000i 自動血液分析儀進行血常規各指標的檢測。

1.2.3 凝血四項的測定 雄性Wistar 大鼠(180～200 g),腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈取血,注入有3.8%枸櫞酸鈉的抗凝管中,顛倒混勻,3 000 r/min 離心15 min,上清為待測血漿。取1.45 mL 血漿,加入0.05 mL PPD,混合均勻后在37 ℃烘箱中孵育10 min,根據凝血酶原時間(PT)、活化的部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT) 和纖維蛋白原濃度(FIB) 測定試劑盒說明書,應用H1201 自動凝血分析儀(江蘇霍納醫療器械有限公司,中國) 進行檢測(具體步驟略)。血液標本在4 h 內完成測定。

1.2.4 ELISA 法檢測大鼠血小板cAMP 和cGMP 水平 參考文獻方法［18］,從雄性Wistar 大鼠腹主動脈取血,3.8%枸櫞酸鈉(1 ∶9) 抗凝。800 r/min離心5 min,吸取上層富含血小板的血漿(PRP)。室溫下,2 500 r/min 離心8 min,棄去上清液,得到血小板團塊。加入適量Tyrode’ s buffer (137 mmol/L NaCl,2 mmol/L KCl,1 mmol/L CaCl2,12 mmol/L NaHCO3,5 mmol/L HEPES,0.35% FBS,pH 7.4),反復洗滌2 次,重懸血小板。取145 μL 洗滌血小板與5 μL 不同濃度的PPD (終濃度為35、70、140 μmol/L),37 ℃恒溫孵育30 min,加150 μL 10 mmol/L EDTA 終止反應。置于-80 ℃冰箱,反復凍融5 次,4 ℃4 000 r/min 離心10 min,收集上清液,按照大鼠環磷酸腺苷(cAMP) 和大鼠環磷酸鳥苷(cGMP) 酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作,酶標儀測定OD 值,根據標準曲線計算出每個樣品中cAMP 和cGMP 的水平。

1.2.5 洗滌血小板的制備 健康志愿者肘靜脈采血或雄性Wistar 大鼠(180～200 g) 腹主動脈取血,3.8%枸櫞酸鈉(1 ∶9) 抗凝。800 r/min 離心5 min,吸取上層富血小板血漿 (platelet-rich plasma,PRP)；取PRP 血漿2 500 r/min 離心8 min,棄去上清液,得到濃縮血小板團塊,加入適量Tyrode’s buffer,反復洗滌2 次,重懸血小板；用血細胞自動分析儀測定血小板數目,用Tyrode’s buffer調整洗滌人或大鼠血小板數目為3×108/mL。

1.2.6 ［Ca2+］i測定 取洗滌人血小板,加入Fluo-3AM (終濃度為5 μmol/L) 輕搖混勻后,避光放置37 ℃烘箱中孵育60 min,棄去熒光探針,用Tyrode’ s buffer 重懸血小板,調整血小板濃度為3×108/mL。取140 μL 負載Fluo-3 的血小板加入96 孔板(黑色,不透明),每孔加入藥物10 μL,溶劑作為空白對照,應用Cytation 5 多功能酶標儀每隔18 s 測定血小板胞漿內［Ca2+］i,總檢測時間為20 min。設置激發波長為488 nm,發射波長為525 nm,［Ca2+］i測定公式為:［Ca2+］i=Kd× (FFmin)/(Fmax-F),式中Kd是Ca2+結合Fluo 3-AM 的解離常數,為525 nmol/L (37 ℃)［19］；F為各樣本熒光強度的測定值。Fmin和Fmax分別是最小熒光強度和最大熒光強度的測定值。Fmin和Fmax是分別在血小板中加入10 mmol/L EGTA 和0.1% Triton X-100 測定的熒光強度值。

1.2.7 血小板聚集率檢測 本實驗應用Chrono-log 700 血小板聚集儀采用比濁法測定血小板聚集率,轉速為1 000 r/min,溫度(37±1)℃。取洗滌大鼠/人血小板270 uL 加入反應杯,放入血小板聚集儀,調整基線,分別加入30 μL 甲醇和PPD (終濃度為17.5、35、70、140、280 μmol/L),待血小板聚集到達最高聚集率后停止記錄。上述實驗重復進行3 次。

1.2.8 流式細胞分析儀測定CD62P (P-選擇素)的表達率和胱冬肽酶原激活物1 (procaspase activating compound 1,PAC-1) 結合率 取洗滌人血小板加入10 mmol/L CaCl2,使CaCl2終濃度為1 mmol/L。取含1 mmol/L CaCl2洗滌人血小板,加入不同濃度的PPD 放置37 ℃烘箱中孵育5 min,然后分別加入CD62P (FITC 標記的P-選擇素) 和PAC-1 (FITC 標記的PAC-1),室溫避光放置20 min,加入200 μL PBS 終止反應,使用流式細胞分析儀收集10 000 個血小板,分別計算CD62P的表達率和PAC-1 結合率。

1.3 統計學分析 通過GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行處理,數據以() 表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05 表示差異具有明顯統計學意義。

2 結果

2.1 PPD 對小鼠出血時間的影響 從表1 可以看出,與空白對照組比較,3 個劑量組PPD 能縮短小鼠斷尾出血時間和小鼠肝劃傷出血時間,各給藥組均能降低小鼠斷尾出血時間(P＜0.05 或P＜0.01),同時PPD 減少了小鼠肝劃痕出血時間(P＜0.01)。

表1 PPD 對小鼠斷尾模型和肝劃痕模型出血時間的影響（， n=8）Tab.1 Effect of PPD on mouse bleeding time at tail amputation model and liver scratch model （， n=8）

表1 PPD 對小鼠斷尾模型和肝劃痕模型出血時間的影響（， n=8）Tab.1 Effect of PPD on mouse bleeding time at tail amputation model and liver scratch model （， n=8）

注:與空白對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 PPD 對大鼠血常規的影響 從表2～4 可以看出,與空白對照組比較,紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB) 和血小板(PLT) 參數均有明顯變化。紅細胞參數方面,與空白對照組比較,中劑量PPD 組增加大鼠RBC 數量(P＜0.01),見表2；低劑量PPD 組和中劑量PPD 組增加血漿中紅細胞壓積(HCT) (P＜0.05)。血紅蛋白參數方面,低劑量PPD 組中平均血紅蛋白量(MCH) 與空白對照組相比增高(P＜0.05),各給藥組大鼠HGB 數量及平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC) 略有升高,但無明顯差異(P＞0.05)。血小板參數方面,與空白對照組比較,中劑量PPD 組和高劑量PPD組能增加大鼠血清中血小板計數(PLT) 和血小板壓積(PCT) (P＜0.05,P＜0.01),見表4。與空白對照組比較,大鼠血清中其他血細胞參數(如白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等) 無明顯差異(P＞0.05)。

表2 PPD 對大鼠紅細胞參數的作用（， n=8）Tab.2 Effect of PPD on parameters of red blood cell in rats （， n=8）

表2 PPD 對大鼠紅細胞參數的作用（， n=8）Tab.2 Effect of PPD on parameters of red blood cell in rats （， n=8）

注:與空白對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

表3 PPD 對大鼠血紅蛋白參數的作用（， n=8）Tab.3 Effect of PPD on parameters of hemoglobin in rats （， n=8）

表3 PPD 對大鼠血紅蛋白參數的作用（， n=8）Tab.3 Effect of PPD on parameters of hemoglobin in rats （， n=8）

注:與空白對照組比較,*P＜0.05。

表4 PPD 對大鼠血小板參數的作用（， n=8）Tab.4 Effect of PPD on parameters of platelet in rats （， n=8）

表4 PPD 對大鼠血小板參數的作用（， n=8）Tab.4 Effect of PPD on parameters of platelet in rats （， n=8）

注:與空白對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.3 PPD 對大鼠凝血四項的影響 從表5 可以看出,PPD 各給藥組與空白對照組比較,PPD 3 個劑量組均能縮短大鼠APTT (P＜0.01 或P＜0.05),中劑量PPD 組、高劑量PPD 組增加纖維蛋白原水平(P＜0.05,P＜0.01),而對大鼠血漿TT 和PT沒有明顯差異(P＞0.05)。

表5 PPD 對大鼠凝血四項的作用（， n=3）Tab.5 Effect of PPD on plasmatic coagulation parameters of rats （， n=3）

表5 PPD 對大鼠凝血四項的作用（， n=3）Tab.5 Effect of PPD on plasmatic coagulation parameters of rats （， n=3）

注:與空白對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.4 PPD 對大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的影響 血小板內cAMP 和cGMP 依賴蛋白激酶調節血小板的功能,在誘導和抑制血小板聚集過程中具有調節作用［20］。從表6 可以看出,與空白對照組比較,各給藥組能抑制大鼠cAMP 的產生(P＜0.01),呈劑量依賴性,當PPD 濃度為140 μmol/L 時,PPD對大鼠cAMP 的產生抑制作用最強；而對cGMP 的產生沒有影響(P＞0.05)。

表6 PPD 對大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的作用（，n=3）Tab.6 Effects of PPD on plasmatic cAMP and cGMP levels of rats （， n=3）

表6 PPD 對大鼠血漿cAMP 和cGMP 水平的作用（，n=3）Tab.6 Effects of PPD on plasmatic cAMP and cGMP levels of rats （， n=3）

注:與空白對照組比較,**P＜0.01。

2.5 PPD 促進血小板Ca2+內流 血小板胞質內游離Ca2+濃度的升高在血小板活化中起到重要作用［21］,因此本實驗進一步檢測PPD 對血小板鈣離子內流的作用。圖1A 顯示,隨著PPD 對洗滌人血小板作用時間增加,血小板內［Ca2+］i增加,而凝血酶的作用比較強,加入瞬間就可以增加血小板內［Ca2+］i。圖1B 顯示,與溶劑對照組比較,140 μmol/L PPD 在5 min 時增加［Ca2+］i(P＜0.05),隨著作用時間增加,70、35 μmol/L PPD 分別在10、15 min 增加［Ca2+］i(P＜0.05)。

2.6 PPD 對洗滌大鼠/人血小板聚集的影響 血小板聚集是指血小板之間相互黏著、聚集成團的現象,是血小板的主要功能之一,在生理性止血和病理性血栓形成中均占重要地位［22］。從表7 可以看出,與空白對照組比較,PPD 可增加洗滌大鼠/人血小板聚集并呈劑量依賴性,濃度大于35 μmol/L可增加大鼠血小板的聚集率；在濃度大于140 μmol/L時,PPD 對洗滌大鼠/人血小板的聚集率增加趨勢均不明顯；當濃度為140 μmol/L 時,大鼠血小板聚集度為40.43%,人血小板聚集度為28.25%。

圖1 PPD 對血小板內［Ca2+］i 濃度的作用Fig.1 Effect of PPD on the ［Ca2+］i of platelets

表7 PPD 對洗滌血小板的聚集作用（， n=3）Tab.7 Aggregation effect of PPD on washing platelets （， n=3）

表7 PPD 對洗滌血小板的聚集作用（， n=3）Tab.7 Aggregation effect of PPD on washing platelets （， n=3）

注:與空白對照組比較,**P＜0.01。

2.7 PPD 促進CD62P 表達 CD62P 存在于靜息血小板的α 顆粒中；血小板活化時釋放CD62P,參與血小板黏附、聚集等一系列反應。CD62P 是血小板活化的主要指標［23］。從圖2B 可以看出,隨著PPD 濃度增加,血小板CD62P 表達率增加；與空白組比較,PPD 濃度大于17.5 μmol/L 時能增加血小板CD62P 表達率(P＜0.01)；當PPD 濃度達到140 μmol/L 時,血小板 CD62P 表達率為81.90%,表達率與凝血酶作用相當。但圖2A 顯示,140 μmol/L PPD 作用明顯弱于凝血酶。

圖2 PPD 對血小板α 顆粒物質釋放的作用Fig.2 Effect of PPD on α granule release of platelets

2.8 PPD 增加血小板PAC-1 的結合率 PAC-1 是血小板膜糖蛋白(GP) IIb/IIIa 復合物,血小板活化后構型會發生改變,PAC-1 是評價血小板活化的重要指標［24］。從圖3 可以看出,隨著PPD 濃度增加,血小板PAC-1 的結合率增加。與溶劑對照組比較,PPD 濃度大于17.5 μmol/L 時能增加血小板PAC-1 結合率；當PPD 濃度達到140 μmol/L 時,血小板PAC-1 結合率為90.40%,其作用與凝血酶的作用相當。

圖3 PPD 對血小板PAC-1 結合率的作用Fig.3 Effect of PPD on PAC-1 binding rate of platelets

3 討論

三七中原人參二醇型皂苷約占總皂苷的60%以上［25］,其在體內經在酸、堿等條件下可水解脫去糖鏈,得到 20 (S) -原人參二醇皂苷元(PPD)［13-14］,是重要的活性成分。本研究通過體內、體外實驗發現原人參二醇具有止血作用并對其作用機制進行初步探討。

小鼠斷尾和肝臟劃痕模型是篩選止血藥物常用的模型［26-27］,實驗結果發現PPD 能抑制小鼠出血時間。通過檢測大鼠的血常規,發現原人參二醇可提高PLT、PCT、紅細胞參數中的RBC 和HCT,RBC 是止血過程中的重要參與者［28］,而PCT 和HCT 升高與靜脈血栓形成密切相關［29-30］。因此,以上體內實驗結果顯示PPD 通過增加PLT 和RBC數量,影響PCT 和HCT,參與止血過程。

凝血四項是研究藥物參與內源性和外源性凝血途徑的檢測方法［31］。PT 和APPT 分別是外源性和內源性凝血系統常用的篩選實驗；TT 反映凝血共同途徑纖維蛋白原轉變為纖維蛋白的所需時間；FIB 在凝血酶水解下最后形成不溶性的纖維蛋白,進而止血。本實驗結果中PPD 可縮短APTT,增加FIB 的水平,表明PPD 可激活內源性凝血途徑,促進FIB 生成,從而發揮止血作用。

cAMP 和cGMP 是調節血小板功能的抑制性細胞內第二信使,可誘導血小板聚集［32-33］。cAMP 水平與［Ca2+］i呈負相關［34］,鈣離子廣泛參與血小板的活化過程,Ca2+的升高可改變血小板的形態,顆粒釋放和GP-IIb/IIIa 活化［21］。本研究體外實驗結果中PPD 能抑制血小板內cAMP 釋放,促進血小板Ca2+內流；同時可直接誘導洗滌大鼠/人血小板聚集。以上結果表明PPD 通過抑制cAMP 釋放,升高細胞內Ca2+水平,激活血小板,觸發血小板的變形,并誘導血小板聚集而達到止血的作用。

CD62P 是細胞黏附分子選擇素家族成員之一。血小板活化時CD62P 從α 顆粒中釋放與血小板表面的胞膜融合,參與血小板黏附、聚集等一系列反應。PAC-1 是活化血小板上的GP Ⅱb/Ⅲa 復合物［24］。當血小板受到刺激時,血小板由膜內向膜外的信號轉導引起血小板空間構型改變,形成活化的GPⅡb/Ⅲa 復合物,促進其與纖維蛋白原結合,引起纖維蛋白原構型改變［35］。CD62P 和PAC-1 是早期血小板活化最特異性的標志物［36］。結果顯示PPD 能增加CD62P 釋放和PAC-1 表達率,表明PPD 通過促進顆粒物質的釋放、膜蛋白與血小板表面黏附以及GPⅡb/Ⅲa 復合物與纖維蛋白原結合,促進血小板聚集。

綜上所述,PPD 可能是一方面通過激活大鼠的內源性凝血系統,影響體內血小板和紅細胞參數,促進血漿中纖維蛋白原生成；另一方面通過影響鈣離子和cAMP 信號通路,增加血小板Ca2+內流、CD62P 釋放和促進PAC-1 的表達,誘導血小板聚集,達到止血的作用。本研究對PPD 的止血作用機制進行了初步的探討,為三七藥物的功效物質基礎研究奠定基礎。