喀什小檗葉不同萃取部位舒張血管活性的篩選

熱米萊·塔衣爾，買爾旦·玉蘇甫，徐勤偉，王阿西，阿力婭·吐遜江，池峙瑾，周文婷

(新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011）

喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.隸屬小檗科小檗屬,在新疆喀什地區野生生長,偶有種植,其果實可藥食兩用,具有活血、利膽、防治高血壓以及抗炎等功效［1］。小檗屬植物具有較高的藥用價值,其根、根莖和根皮均為常見用藥部位。然而近年來,對于藥用植物非藥用部位的研究開發受到了不少學者的關注。以往藥用植物傳統的藥用部位被廣泛應用,而非藥用部位往往被廢棄。研究表明,藥用植物非藥用部位常具有與藥用部位類似的化學基礎,同樣具有較好的生物活性。因此,研究非藥用部位,對于發展新藥物、擴大藥用部位、綜合利用藥材資源,從而加強非藥用部位的應用與開發,實現中藥的可持續發展有重要的意義［2-3］。目前有關喀什小檗的研究主要集中在果實,對非傳統藥用部位喀什小檗葉的研究報道甚少,大量葉資源未開發利用。因此,本研究擬通過采用離體血管灌流實驗方法,觀察喀什小檗葉是否具有舒張血管活性,并篩選有效部位,進一步對作用機制進行初步探討,旨在為研究開發喀什小檗葉的藥用價值奠定一定研究基礎。

1 材料

1.1 儀器 Power Lab 生物信號處理系統(澳大利亞AD Instruments 公司)；四通道橋式放大器(澳大利亞AD Instruments 公司)；LE01046 型恒溫離體組織器官灌流儀(西班牙Pan lab 公司)；RE-52AA 型旋轉蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；X205BDU 型電子天平(瑞士梅特勒-儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 喀什小檗葉采集自新疆喀什地區,由新疆醫科大學藥學院天然藥物化學與生藥學教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為小檗科小檗屬喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.的葉；去氧腎上腺素 (PE,阿拉丁試劑有限公司,批號H1420012)；乙酰膽堿(Ach；美國Sigma 公司,批號BCBR3 675 V)；N-硝 基-L-精氨酸甲 酯 (LNAME；美國Sigma 公司,批號WXBC6 454 V)。其余化學試劑均為國產分析純。Kreb-Henseleit (K-H)液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、葡萄糖11.1 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L,pH 7.4)。

1.3 動物 SPF 級雄性SD 大鼠,體質量200～250 g,由新疆醫科大學動物實驗中心提供,動物生產許可證號SCXK (新) 2018-0003。

2 方法

2.1 喀什小檗葉不同萃取部位的制備 取喀什小檗葉0.5 kg,按照料液比1 ∶10 加入體積分數為60%的乙醇,回流提取3 次,每次2 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮,真空干燥,可得喀什小檗葉乙醇提取物浸膏,1 g 浸膏相當于3.70 g 原藥材。用1 000 mL 蒸餾水溶解一部分乙醇提取物,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取多次至萃取完全,將所得到的各萃取液分別合并,減壓濃縮,真空干燥,可得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各萃取部位用含0.2%二甲基亞砜(DMSO) 的K-H 液溶解(已有文獻報道0.2% DMSO 對血管張力無影響［4］)。

2.2 大鼠離體胸主動脈環的制備［5］頸椎脫臼處死SD 大鼠,迅速打開胸腔,取出胸主動脈并置于4 ℃預冷K-H 液中(用95%O2和5%CO2混合氣體預飽和),小心清除血管周圍的脂肪和結締組織后,剪成長度3 mm 左右的4 個血管環。操作過程中避免過度牽拉,以防損傷至動脈失活。去內皮血管環,用牙簽輕輕地來回滾動血管環內表面去除內皮細胞來制備,未去除內皮細胞的血管環為內皮完整血管環。將血管環一端固定于具有10 mL K-H 液的浴槽中(浴槽內K-H 液溫度恒溫37 ℃,持續不斷的通入95% O2和5% CO2混合氣體),一端連于張力換能器,用Power Lab 生物信號處理系統記錄血管環張力的變化。血管環起始張力在1.0 g 狀態下穩定60 min,每15 min 換1 次K-H 液。用1 μmol/L PE 預收縮血管環,待血管環張力穩定后給予10 μmol/L 的Ach 舒張血管環以檢查血管環內皮的完整性,舒張率達到75%以上判斷為內皮完整,小于15%可認為是去內皮血管。計算公式如下。

2.3 喀什小檗葉不同萃取部位對PE 預收縮的內皮完整血管環的舒張作用 以1 μmol/L PE 預收縮各浴槽內的內皮完整血管環,采用累計給藥法往各浴槽內分別加入喀什小檗葉不同萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位終濃度依次達到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環張力的變化。空白組以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗葉不同萃取部位,并于給藥組相同的時間記錄血管環張力的變化。

2.4 喀什小檗葉不同萃取部位對PE 預收縮的去內皮血管環的舒張作用 以1 μmol/L PE 預收縮各浴槽內的去內皮血管環,采用累計給藥法往各浴槽內分別加入喀什小檗葉不同萃取部位(乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位),使不同萃取部位終濃度依次達到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環張力的變化。空白組以等容K-H 液(含0.2% DMSO) 代替喀什小檗葉不同萃取部位,并與給藥組相同的時間記錄血管環張力的變化。

2.5L-NAME 對喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響 將內皮完整血管環分兩組,分別為L-NAME 組和乙酸乙酯部位組。L-NAME 組用LNAME (100 μmol/L) 孵育20 min,乙酸乙酯部位組加等容K-H 液孵育20 min,然后用PE(1 μmol/L) 預收縮各組血管環,再往各組浴槽內分別逐步加入喀什小檗葉乙酸乙酯部位,使終濃度達0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL,每隔5 min 加一次藥,記錄血管環張力的變化。

2.6 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理,數據以() 表示,2 組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析(α=0.01)。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 血管環內皮完整性檢查 Ach 可明顯舒張PE預收縮的內皮完整血管環,但是對PE 預收縮的去內皮血管環幾乎沒有舒張作用,故本實驗通過Ach(10 μmol/L) 對PE (1 μmol/L) 預收縮的內皮完整血管環(或者去內皮血管環) 的舒張率來判斷血管環的內皮是否完整(或者去內皮血管環是否建立成功)。若血管環舒張率達到75%以上判斷為內皮完整的血管環,可用于內皮完整實驗組；若血管環舒張率小于15%可認為去內皮血管,可用于去內皮實驗組。本實驗中Ach 對PE 預收縮的內皮完整血管環和去內皮血管的舒張率分別為(91.25±3.12)%和(6.04±5.47)%,見圖1。

圖1 Ach 對PE 預收縮的內皮完整血管環（A） 和去內皮血管環（B） 的舒張作用Fig.1 Relaxation effectss of Ach on PE-pretreated endothelial-intact （A） and endothelial-free （B）aortic rings

3.2 喀什小檗葉不同萃取部位對PE 預收縮的內皮完整血管環的舒張作用 喀什小檗葉石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位對PE預收縮的內皮完整血管環的最大舒張率Emax分別為(41.59±9.08)%、(94.66±5.19)%、(50.26±14.78)%、(42.35±7.73)%。與空白組比較,只有乙酸乙酯部位可濃度依賴性的舒張PE 預收縮的內皮完整血管環,差異具有統計學意義 (P＜0.01),見圖2。

3.3 喀什小檗葉不同萃取部位對PE 預收縮的去內皮血管環的舒張作用 喀什小檗葉石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位對PE 預收縮的去內皮血管環的最大舒張率Emax分別為(41.31 ± 5.37)%、(92.49 ± 6.73)%、(39.26 ±10.78)%、(45.66±7.26)%。與空白組比較,只有乙酸乙酯部位可濃度依賴性舒張PE 預收縮的去內皮血管環,差異具有統計學意義(P＜0.01),見圖3。喀什小檗葉乙酸乙酯部位對PE 預收縮的內皮完整血管環和去內皮血管環均有濃度依賴性舒張作用,Emax分別為(94.66±5.19)%、(92.49±6.73)%,差異無統計學意義(P＞0.05),見圖4。

圖2 喀什小檗葉不同萃取部位對內皮完整血管環的舒張作用Fig.2 Relaxation effectss of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact aortic rings

圖3 喀什小檗葉不同萃取部位對去內皮血管環的舒張作用Fig.3 Relaxation effects of different extracts of B.kaschgarica leaves on endothelial-free aortic rings

圖4 喀什小檗葉乙酸乙酯部位對內皮完整血管環和去內皮血管環的舒張作用Fig.4 Relaxation effects of ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves on endothelial-intact and endothelial-free aortic rings

3.4L-NAME 對喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響 喀什小檗葉乙酸乙酯部位對LNAME 組和乙酸乙酯部位組(與未經L-NAME 預處理) 的血管環均具有濃度依賴性的舒張作用,Emax分別為(96.37±10.37)%、(94.66±5.19)%,差異無統計學意義(P＞0.05),見圖5。

圖5 L-NAME 對喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用的影響Fig.5 Effects of L-NAME on vasorelaxation induced by ethyl acetate extract of B.kaschgarica leaves

4 討論

高血壓是嚴重威脅人類健康的疾病,也是導致心血管疾病患者死亡的主要危險因素。長期血壓增高是導致中風、冠心病以及腎衰的危險因素之一［6］。目前已有不同種類的抗高血壓藥在臨床廣為應用,但均有一定的毒副作用,故在天然植物中尋找具有舒張血管作用的高效、低毒活性組分仍有較大的意義和研究前景［7］。液-液萃取法是根據“相似相溶” 原理對物質進行分離。由于萃取溶劑的極性不同,極性弱的成分分配到極性弱的溶劑中,極性強的成分分配到極性強的溶劑中。本實驗中以喀什小檗葉為研究對象,利用液-液萃取法對喀什小檗葉醇提物進行萃取,得到不同極性的采取部位(極性強弱順序為石油醚部位＜乙酸乙酯部位＜正丁醇部位＜水部位),再利用離體血管實驗方法對不同萃取部位進行舒張血管活性篩選,結果表明喀什小檗葉乙酸乙酯部位具有顯著的舒張血管作用。

血管由單層的血管內皮細胞和血管平滑肌組成［8］。血管內皮細胞作為血液和血管平滑肌之間的機械屏障,在調節血管張力、血管生成、代謝、炎性細胞黏附、血小板凝聚、血管通透性等方面起著重要的作用,其功能損傷與多種心血管疾病的發生、發展密切相關［9-10］。舒張血管作用通過內皮依賴性和非內皮依賴性等兩種途徑產生,內皮依賴性舒張血管作用是通過促進血管舒張因子的釋放和抑制血管收縮的釋放來產生,非內皮依賴性舒張血管作用是通過阻滯鈣離子通道或者開放鉀離子通道來產生［11］。本實驗中喀什小檗葉乙酸乙酯部位對內皮完整和去內皮血管環均有濃度依賴性舒張血管作用,并且去內皮處理后,其作用強度無明顯差異(P＞0.05),說明喀什小檗葉乙酸乙酯部位可能通過非內皮途徑介導血管環的舒張作用。

NO 是以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶(eNOS) 的催化下生成的最重要的舒張血管因子。本實驗中內皮完整離體血管環經一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME) 預處理后,喀什小檗葉乙酸乙酯部位對內皮完整血管環的舒張血管作用沒有受到抑制,說明喀什小檗葉乙酸乙酯部位舒張血管作用與內皮源性NO 釋放無關。

血管平滑肌的收縮與舒張受多種離子的共同調節,其中Ca2+濃度為至關重要,血管平滑肌細胞內Ca2+濃度升高導致血管平滑肌的收縮,細胞內Ca2+來源于從細胞外的Ca2+通過鈣離子通道流入和細胞內儲存鈣釋放［12］。血管平滑肌細胞存在電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channels,VDCCs) 和受體依賴性鈣通道 (receptor-operated calcium channels,ROCCs)［13］。PE 是α1-腎上腺素受體激動劑,激活ROCCs,導致外鈣內流,使細胞內Ca2+濃度升高,最終導致血管收縮,另外PE與α1-腎上腺素受體結合后,通過G 蛋白偶聯受體激活磷脂酶C,從而產生三磷酸肌醇(IP3),IP3與肌質網膜上IP3受體結合,引發肌漿網膜儲存Ca2+的釋放［14］。本實驗中喀什小檗葉乙酸乙酯部位對PE 預收縮血管環具有濃度依賴性的舒張作用,表明其作用機制可能與影響鈣離子有關,然而對于具體的作用機制,是抑制外鈣內流還是抑制內鈣釋放？ 本課題組還將在后續的實驗中給予進一步深入研究。

小檗屬植物全世界分布廣泛,種類較多,喀什小檗為小檗科小檗屬落葉灌木［15-16］,近年來對喀什小檗的研究多為其常見藥用部位果實［17-19］,而非藥用部位(如葉) 往往被廢棄。因此,從喀什小檗葉中提取分離具有舒張血管作用的活性物質,不僅有利于探索具有心血管藥理活性的物質基礎,另外研究開發喀什小檗葉的藥用價值,使之變廢為寶,也有利于新疆地方特色植物資源的充分利用。