白術多糖通過調控TLR4/NF-κB 信號通路對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的影響

江 勇，朱大俠，劉禮劍

(南華大學附屬南華醫院急診科，湖南 衡陽 421002）

重癥急性胰腺炎 (severe acute pancreatitis,SAP) 是一種臨床常見的急危重癥,其發病快、病變復雜、并發癥多且死亡率高,嚴重威脅著人類健康［1］。腸道是SAP 發生應激反應的中心器官,SAP 發生時大量炎癥因子釋放,使腸道出現微循環障礙,并伴隨免疫細胞大量凋亡,導致腸道免疫功能被抑制,腸屏障受損,腸道內細菌和內毒素移位,最終造成胰腺壞死繼發腹腔感染,甚至誘發腹腔室隔綜合征和多器官衰竭綜合征,使胰腺炎病情加重［2-3］。

白術多糖是白術的重要組成成分,具有改善胃腸道功能［4］、調節免疫生物活性［5］、抗腫瘤［6］等作用,但有關白術多糖在重癥急性胰腺炎致腸黏膜免疫屏障損傷中的作用,還未曾報道。TLR4 (Toll樣受體) 是一類天然免疫模式識別受體,可活化NF-κB (核因子-κB) 并促進其下游相關炎性因子的表達。在正常生理條件下TLR4/NF-κB 通路的活化可激活機體免疫應答,然而在炎性病理條件下該通路的活化可引起炎癥級聯反應。有研究顯示［7］,TLR4/NF-κB 通路在SAP 介導的腸黏膜屏障功能障礙中可作為炎癥反應的“閥門”,介導炎性介質的釋放并引起SAP 各器官損傷。白術多糖是否通過TLR4/NF-κB 信號通路參與SAP 腸黏膜免疫屏障的調控,目前鮮有報道。為此,本研究擬通過胰膽管逆行注射牛磺膽酸鈉法建立SAP 大鼠模型,旨在探討白術多糖對急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的保護作用及其對TLR4/NF-κB 信號通路的影響,為其新藥研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(SPF) 級雄性SD 大鼠60 只,鼠齡6～7 周,體質量(250±20) g,由湖南省動物實驗中心提供,動物生產許可證號SCXK(湘) 2019-0023。飼養條件為溫度(23±2)℃,相對濕度50%～70%,12 h/12 h 明暗交替,自由飲食攝水。

1.2 試劑與儀器 白術多糖(多糖質量分數≥95%,批號ZL180112133) 購于南京澤朗生物科技有限公司。注射用烏司他丁(批號C0018021) 購于廣東天普生化醫藥有限公司；牛膽酸鈉(批號20190203006)、蘇木素-伊紅 (HE) 染色試劑盒(批號C233029) 購于上海碧云天生物技術有限公司；白介素-1β (IL-1β,S009591)、白介素-6(IL-6,S006040)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α,S004441) ELISA 試劑盒購于美國R＆D 公司；大鼠分泌性免疫球蛋白A (sIgA) 放射免疫分析藥盒(批號S00569) 購于北京原子高科股份有限公司；TLR-4 (批 號 GR109440-1)、MyD88 (批 號GR133612-2)、p-NF-κB p65 (Ser536) (批 號GR117656-1)、NF-κB p65 (批 號GR129871-4)、GAPDH 抗體購于英國Abcam 公司；熒光抗體APCCD3e (L40095)、CD4-PE (批號L10535)、CD8a-PE (批號L11306) 購于美國Biolegend 公司；石蠟切片機購于德國Leitz 公司；酶標儀購于美國Thermo Fisher Science 公司；熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司；流式細胞儀購于美國BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組 60 只大鼠適應性飼養1 周后,隨機分成5 組,假手術組、SAP 模型組、陽性藥物烏司他丁組、白術多糖低劑量組和白術多糖高劑量組,每組12 只。所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后,采用逆行膽胰管注射5%牛磺膽酸鈉溶液(0.1 mL/100 g,體積流量0.2 mL/min) 建立SAP 模型［8］,注射10 min 后可觀察到胰管走形區域的胰腺組織出現充血、水腫,且隨著時間延長紅腫面積逐漸擴大,表明SAP 模型制作成功,即可逐層縫合并關閉腹腔。假手術組大鼠僅行腹部切口,不注射牛磺膽酸鈉,在閉合腹部前稍微翻動胰腺組織數次。造模成功后立即進行藥物干預,烏司他丁組大鼠通過腹腔注射2×104U/kg 烏司他丁,白術多糖低劑量組和白術多糖高劑量組大鼠分別通過腹腔注射200 mg/kg 和400 mg/kg 白術多糖,而假手術組和SAP 模型組大鼠注射等量生理鹽水,每天1 次,給藥48 h 后處死大鼠取材。

1.3.2 血清淀粉酶及炎癥因子水平檢測 腹主動脈采血并分離血清,采用碘比色法檢測血清淀粉酶活性；采用ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.3.3 HE 染色觀察胰腺和小腸組織病理變化取胰腺組織和小腸組織,洗凈后用10% 福爾馬林固定,石蠟包埋后將石蠟塊4 μm 切片并行蘇木素-伊紅(HE) 染色,于顯微鏡下觀察病理改變,并采用Schmidt 評分標準［9］對胰腺進行病理評分,采用Chui’ s 評分法［10］對小腸組織進行病理評分。

1.3.4 流式細胞術檢測小腸腸黏膜中T 細胞亞群比例 取小腸組織,生理鹽水洗凈剪碎后加入消化酶,于恒溫水浴振蕩器中消化30 min 后經濾網過濾,加入淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。取500 μL調整好濃度的細胞懸液于流式檢測管中,加入APC-CD3e、PE-CD4 和PE-CD8a 抗體,室溫下避光孵育20 min,1 000 r/min 離心10 min,棄上清,加入PBS 緩沖液重懸細胞,上流式細胞儀檢測。以CD3e+CD4+雙陽性細胞亞群百分比表示CD4+T 細胞所占比例,以CD3e+CD8+雙陽性細胞亞群表示CD8+T 細胞所占比例,并計算CD4+/CD8+T 細胞比值。

1.3.5 放射免疫法檢測小腸黏膜中sIgA 水平 取小腸組織,生理鹽水清洗后,以10% 醋酸溶液沖洗腸腔并收集灌洗液,4 ℃條件下20 000 r/min 離心30 min,收集上清液,按照試劑盒說明書進行操作,采用放射免疫分析法檢測slgA 水平。

1.3.6 Western blot 檢測小腸組織中TLR-4/NF-κB通路相關蛋白表達 收集各組大鼠小腸組織置于組織勻漿器內,加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑于冰上碾磨勻漿,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,取上清。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度,取25 μg蛋白進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,并將蛋白轉移至PVDF 膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入TLR-4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和GAPDH 抗體,4 ℃孵育過夜,次日加入相應二抗,室溫孵育1 h,ECL 試劑曝光顯影,在全自動凝膠成像系統中曝光顯影。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。

1.4 統計學分析 所有數據均采用SPSS 22.0 統計學軟件進行統計學分析,計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗,以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白術多糖對SAP 大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平的影響 如表1 所示,與假手術組比較,SAP模型組大鼠血清中淀粉酶活性以及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平增加(P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術多糖高劑量組和烏司他丁組血清中淀粉酶活性及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低(P＜0.01),而白術多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 白術多糖對SAP 大鼠胰腺及小腸組織病理學的影響 如圖1 所示,假手術組大鼠胰腺結構正常,無水腫,無炎性細胞浸潤；SAP 模型組和白術多糖低劑量組大鼠胰腺結構嚴重破壞,間質水腫,大量炎癥細胞浸潤；白術多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠胰腺病理特征較SAP 模型組明顯改善,可觀察到胰腺組織炎癥浸潤水平降低,間質水腫程度減輕,胰腺結構相對較完整。如圖2 所示,假手術組大鼠小腸黏膜絨毛排布規整,刷狀緣光整平滑,未見明顯損傷；SAP 模型組和白術多糖低劑量組大鼠小腸黏膜破損嚴重,小腸黏膜絨毛水腫、萎縮變形、排列紊亂,局部灶性壞死；白術多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸絨毛形態較SAP 模型組相對完整,各層結構相對清晰完整。如表2 所示,與假手術組比較,SAP 模型組大鼠胰腺組織Schmidt 評分和小 腸組織Chui’s 評分增加 (P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠胰腺組織Schmidt 評分和小腸組織Chui’s 評分降低(P＜0.01),而白術多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（， n=12）Tab.1 Comparison of serum levels of amylase and inflammatory factors in rats among various groups （， n=12）

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（， n=12）Tab.1 Comparison of serum levels of amylase and inflammatory factors in rats among various groups （， n=12）

注:與假手術組比較,**P＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

圖1 各組大鼠胰腺組織切片病理變化（HE 染色，×200）Fig.1 Pathological changes of pancreas tissue sections of rats in various groups （HE staining，×200）

圖2 各組大鼠小腸組織切片病理觀察（HE 染色，×200）Fig.2 Pathological changes of small intestine tissue sections in rats in various groups （HE staining，×200）

表2 各組大鼠胰腺和小腸組織病理學評分（， n=12）Tab.2 Pathological scores of small intestine tissue and pancreas of rats in various groups （， n=12）

表2 各組大鼠胰腺和小腸組織病理學評分（， n=12）Tab.2 Pathological scores of small intestine tissue and pancreas of rats in various groups （， n=12）

注:與假手術組比較,** P ＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

2.3 白術多糖對SAP 模型大鼠小腸黏膜中T 細胞亞群比例及sIgA 水平的影響 如表3 所示,與假手術組比較,SAP 模型組大鼠小腸黏膜中CD4+T細胞亞群比例及CD4+/CD8+比值和sIgA 水平降低(P＜0.01),而CD8+T 細胞亞群比例升高 (P＜0.01)；與SAP 模型組比較,白術多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸黏膜CD4+T 細胞亞群比例及CD4+/CD8+比 值、sIgA 水平增加 (P＜0.01),CD8+T 細胞亞群比例降低(P＜0.01)；白術多糖低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。

表3 各組大鼠腸黏膜中T 細胞亞群比例及sIgA 水平比較（， n=12）Tab.3 Comparison of T cell subsets and sIgA levels in intestinal mucosa of rats among various groups （， n=12）

表3 各組大鼠腸黏膜中T 細胞亞群比例及sIgA 水平比較（， n=12）Tab.3 Comparison of T cell subsets and sIgA levels in intestinal mucosa of rats among various groups （， n=12）

注:與假手術組比較,**P＜0.01；與SAP 模型組比較,＃＃P＜0.01。

2.4 白術多糖對SAP 大鼠小腸組織中TLR-4/NFκB 信號通路蛋白表達的影響 如圖3 所示,與假手術組比較,SAP 模型組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65 水平升高(P＜0.01),而NF-κB p65 蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)；與SAP 模型組比較,白術多糖高劑量組和烏司他丁組大鼠小腸組織中MyD88、TLR-4 蛋白及p-NF-κB p65 水平降低(P＜0.01),NF-κB p65 蛋白表達無明顯變化(P＞0.05),而白術多糖低劑量組與SAP模型組比較以上蛋白表達水平無明顯差異(P＞0.05)。

圖3 各組大鼠小腸組織TLR-4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 （Ser536） 蛋白表達Fig.3 Protein expressions of TLR-4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 （Ser536） in small intestine of rats in various groups

3 討論

在SAP 的發病過程中,胰腺細胞釋放大量炎癥介質和細胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等,這些炎癥因子之間相互作用,導致促炎與抗炎細胞因子系統失衡,引發全身炎癥反應［11］。免疫球蛋白sIgA 主要存在于黏膜上層的黏液中,是黏膜局部免疫反應的主要抗體,sIgA 水平下降表示局部免疫功能下降,而sIgA 分泌減少可降低腸道抵御細菌和毒素入侵的能力,且易激活細胞炎性因子,產生過度炎性反應,進一步損害腸黏膜［12］。血清淀粉酶是SAP 診斷中最常用的生化標志物。姚金鋒［13］等人研究顯示,SAP 大鼠胰腺組織出現嚴重炎癥反應,腸黏膜組織受到破壞,血清淀粉酶活性明顯上升,同時小腸黏膜sIgA 水平顯著下調。本研究結果顯示,高劑量白術多糖可降低SAP 大鼠血清中淀粉酶活性以及炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平,下調腸黏膜中sIgA 水平,說明白術多糖可以通過降低腸道黏膜通透性、改善腸道免疫屏障功能起到保護SAP 大鼠腸道黏膜的作用。

CD4+T、CD8+T 淋巴細胞和CD4+T/CD8+T 值的改變代表機體免疫功能的改變,一定程度上也是反映SAP 損傷嚴重程度的敏感指標［14］。Liu 等［15］人在對76 名SAP 患者的研究中發現,患者外周血中CD4+T 細胞比例和CD4+/CD8+比值較正常人明顯下調；Wang［16］研究SAP 大鼠腸道免疫功能的變化發現,SAP 發生后CD4+T、CD4+T/CD8+T 比值明顯下降,CD8+T 細胞比例上調,說明大鼠早期即發現腸黏膜免疫功能明顯下降。本研究結果顯示,與假手術組比較,SAP 模型組大鼠小腸黏膜中CD4+T 細胞亞群比例和CD4+/CD8+比值降低,而CD8+T 細胞亞群比例顯著升高,與前人研究一致,而高劑量白術多糖治療組大鼠腸黏膜中CD4+T細胞亞群比例、CD4+/CD8+比值明顯回升,而CD8+T 細胞亞群比例明顯下調,說明白術多糖可以通過改善機體T 細胞亞群免疫功能,減輕腸道炎癥反應和損傷,進而起到保護腸黏膜免疫屏障的作用。

TLR4/NF-κB 通路是近些年來發現與抗炎免疫機制密切相關的信號通路,NF-κB 的異常活化引起炎性細胞因子的失控釋放,是導致胰腺外損傷的重要機制［17］。NF-κB 信號通路受多種上游信號分子刺激而激活,TLR4 是其中之一。有研究顯示［18］,SAP 時內毒素進入血液,其結構成分脂多糖被轉運至細胞膜表面被TLR4 識別后啟動細胞內信號傳導,使NF-κB 從胞漿轉到核內,誘導多種細胞因子如IL-6、IL-1β 等的合成,破壞腸黏膜屏障。本研究Western blot 結果顯示,與假手術組比較,SAP 模型組大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白以及p-NF-κB p65 水平均顯著上升,與蘭濤等［19］研究一致,而高劑量白術多糖干預組能降低大鼠小腸組織中TLR4、MyD88 蛋白和p-NF-κB p65 表達水平,由此可以推測SAP 誘導的腸黏膜免疫屏障損傷與TLR4/NF-κB 信號通路的激活有關,而白術多糖可以通過抑制TLR4/NF-κB 信號活化,保護SAP大鼠腸黏膜免疫屏障功能不受損傷。

綜上所述,白術多糖可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,減輕SAP 大鼠炎癥反應,提高腸道sIgA 水平,增加腸黏膜中T 細胞亞群比例,改善胰腺組織和小腸組織病理損傷,保護腸黏膜免疫屏障。