川芎質量標準的研究

胡 楊，丁曉倩，嚴 輝*，吳垠志，彭國平，黃勝良

(1.南京中醫藥大學，江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室，江蘇 南京 210023；2.江蘇融昱藥業有限公司，江蘇 淮安 223001）

中藥材的質量是整個中醫藥產業鏈的基石,中共中央、國務院發布《關于促進中醫藥傳承創新發展的意見》,提出“大力推動中藥質量提升和產業高質量發展”,要求“加強中藥材質量控制,促進中藥飲片和中成藥質量提升,促進中藥飲片優質優價”［1］。然而目前市場用于規范中藥材質量的法定標準《中國藥典》 實行的是最低準入標準,除少數品種外大多未規定其農藥殘留、重金屬等指標［2］,也未對藥材商品規格等級做進一步區分。

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.(L.chuanxiong) 的干燥根莖,始載于《神農本草經》,列為上品,具有活血行氣、祛風止痛之功效,是臨床常用的大宗中藥材［3-4］。傳統川芎的商品等級劃分主要依據其個頭大小,但劃分的科學內涵尚不明確,現行川芎質量標準含量測定項下僅對阿魏酸進行限定,檢測指標單薄,無法全面的評價藥材飲片的質量優劣［5］。同時,被譽為“產后第一方” 的新生化顆粒,由當歸、川芎、益母草、桃仁和紅花等7 味藥組成,在婦科用藥領域需求量大?，F行質量控制標準為國家藥品標準(WB3-B-1056-91-2015),該標準只收載了理化鑒別項生物堿的沉淀反應及當歸、川芎中僅以阿魏酸為對照的薄層鑒別,不利于生產和使用的相關部門控制其藥品質量［6］。而對源頭藥材的質量標準提升可以更好的全面控制［7］。本研究在2020 年版《中國藥典》 川芎項下檢測項目基礎上,建立了川芎藥材多指標成分檢測方法,增加川芎重金屬和有害元素殘留量,農藥殘留量檢測限,同時使用一測多評法對川芎5 種指標成分進行測定,以期尋找川芎藥材等級與各質控項之間的內在關聯,客觀有效表征川芎優質藥材標準,為提升新生化顆粒等含川芎組方產品的質量提供科學依據。

1 材料

BP211D 型電子天平［賽多利斯科學儀器(北京) 有限公司］；RT-1236 型馬弗爐(北京盈安美誠科學儀器有限公司)；NexION 350D 型電感耦合等離子體質譜儀(美國Perkin Elmer 公司)；TSQ 8000 EVO 氣相色譜串聯質譜分析儀(美國賽默飛公司)；2695 型高效液相色譜儀、2998PDA 型紫外檢測器(美國Waters 公司)；Anke TGL-16B 離心機(上海安亭科學儀器廠)；HG-9023A 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；KH-500DB 型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；XFB-200 型高速中藥粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)。

阿魏酸對照品(批號110773-201614,純度≥99%,中國食品藥品檢定研究院)；藁本內酯、丁烯基苯酞對照品 (批號分別為 CHB160428、CHB160404,純度≥98%,南京金益柏生物科技有限公司)；阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A (批號分別為lw80315016、lw18050223,純度≥98%,南京良緯生物科技有限公司)；洋川芎內酯Ⅰ、綠原酸、洋川芎內酯H (純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國Tedia公司)；冰醋酸等試劑為分析純；超純水(Milli-Q超純水系統制備)。

從江蘇融昱藥業有限公司、四川什邡市隱峰鎮農產品專業合作社等共收集28 批川芎藥材,經南京中醫藥大學藥學院嚴輝副教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別及等級形態學參數測定 依據2020年版《中國藥典》 及《中藥材商品規格等級 川芎》 (TCACM 1021.51—2018) 團體標準對川芎藥材的大小、形狀、色澤及質地等性狀進行描述,利用數碼相機拍攝并記錄。采用四分法對每批樣品進行取樣,隨機選取1 kg 川芎藥材,測定每份樣品個數和質量,重復3 次取平均值,結果發現,川芎一等品每40 個以內/kg,單個質量不低于20 g；二等品70 個以內/kg,單個質量不低于12 g,三等品70 以外/kg,統貨不分大小。

2.2 雜質、水分、灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物 按2020 年版《中國藥典》 (四部)［8］雜質檢查法(通則2301),水分測定法(通則0832)第四法,灰分測定法(通則2302) 項下總灰分及酸不溶性灰分測定法,浸出物測定法(通則2201)項下的醇浸出物測定法(熱浸法) 分別對雜質、水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物進行測定。

2.2.1 雜質檢查 川芎藥材的雜質檢查情況結果發現一、二、三等品無雜質,統貨的雜質質量分數0.2%～3.0%。依據《七十六種藥材商品規格標準》 規定雜質含量不超過10.0%的要求,各批藥材雜質含量符合要求。

2.2.2 水分測定 檢測結果顯示,28 批川芎藥材樣品其水分含量多在6.98%～11.38%范圍內浮動,平均值9.11%,均未超出《中國藥典》 中對中藥藥材含水量不超過12.0% 的限度要求,川芎一等品水分含量9.56%～10.64%,平均值10.15%；二等品水分含量7.57%～7.99%,平均值7.80%；三等品水分含量6.98%～8.73%,平均值8.09%；統貨水分含量8.66%～11.38%,平均值10.41%,見圖1。

圖1 川芎藥材中水分、灰分和醇溶性浸出物含量的頻率分布直方圖Fig.1 Frequency distribution histogram for intrinsic indexes of L.chuanxiong

2.2.3 總灰分和酸不溶性灰分檢測 28 批川芎藥材樣品總灰分在4.03%～7.93%范圍內,酸不溶性灰分在0.75%～3.09%范圍內,不同批飲片灰分測定結果波動大,且總灰分高的酸不溶性灰分也高。部分樣品超出《中國藥典》 中對中藥藥材總灰分和酸不溶性灰分的限度要求 (6 批總灰分大于6.0%,4 批酸不溶性灰分大于2.0%),推測可能與藥材樣品泥沙雜質過多有關,建議市售與產區藥材需要進行雜質清理以便深入進行灰分過高原因探究。

2.2.4 醇溶性浸出物測定 經檢驗,28 批樣品中,醇溶性浸出物含量在16.85%～35.01%范圍內浮動,平均值28.38%,皆大于藥典限定要求的12.0%,結合文獻報道什邡地區川芎浸出物平均值30.91%,分析種質資源對川芎質量影響明顯,同時產地及栽培技術也可能是影響其醇浸出物含量的重要因素［9］,綜合各批結果,參考香港中藥材標準中對川芎浸出物檢測限的規定［10］,建議可提高川芎藥材醇溶性浸出物限度不得小于20.0%,優質藥材限度不得小于25.0%。

2.3 重金屬和有害元素測定 委托南京卡文思檢測技術有限公司,利用NexION 350D 型電感耦合等離子體質譜儀,按《中國藥典》 收載的鉛、鎘、砷、汞、銅測定法(通則2321) 對收集的川芎藥材進行重金屬及有害元素測定,結果見表2。數據顯示,5 種重金屬的殘留量均未超過《中國藥典》所規定的限度,其中鉛、砷2 種元素在川芎藥材中均未檢測出,鎘元素含量在0.44～0.67 mg/kg 范圍內浮動,平均值0.52 mg/kg,與郭蘭萍等［11］統計常用中藥材重金屬超標情況,川芎中鎘含量平均值為(0.54±0.49) mg/kg 一致。

2.4 農藥殘留量測定 在川芎生產過程中,由于遭受根腐病、白粉病、蠐螬、莖節蛾等多種病蟲害,產地藥農多施用化學農藥進行防治。據調查,目前使用的農藥主要有甲基硫菌靈、毒死蜱和擬除蟲菊酯類等［12］。本實驗委托南京卡文思檢測技術有限公司,利用氣相色譜串聯質譜分析儀,按照藥典收載的農藥殘留量測定法(通則2341) 對收集的川芎藥材進行農藥殘留測定,結果見表2,表明9 種農藥殘留量均未超過國家標準所規定的最高限度(GB 2763—2016 《食品安全國家標準——食品中農藥最大殘留限度》),除了統貨CX Ⅳ-7 批的二甲戊靈殘留量(0.297 mg/kg) 超過最高限度(0.2 mg/kg),同時發現統貨批農藥殘留相比什邡產區仍較高,結合文獻報道低劑量使用農藥有利于“高產優質” 川芎藥材的生產,綜合各批結果,建議該9 種農藥殘留量測定限為含敵敵畏不得過0.01 mg/kg；二苯胺不得過0.2 mg/kg；毒死蜱不得過0.1 mg/kg；二甲戊靈不得過0.01 mg/kg；pp-DDT不得過0.01 mg/kg；聯苯菊酯不得過0.02 mg/kg；甲氰菊酯、氯菊酯和溴氰菊酯不得檢出。

表2 樣品中重金屬及農藥殘留含量測定結果（mg/kg， n=3）Tab.2 Results of content determination of heavy metals and pesticide residue in samples （mg/kg， n=3）

2.5 樣品含量測定 川芎中主要含有機酚酸、苯酞、生物堿類成分,但現行《中國藥典》 中川芎含量測定項下僅對阿魏酸進行限定,較為單薄的指標,無法全面的評價藥材質量優劣,同時文獻報道［13］川芎藥材中生物堿成分川芎嗪含量不足萬分之一,故應測定有機酸和苯酞類等主要功效成分的含量以便客觀評價和控制川芎的內在質量。但苯酞類化合物穩定性差,作為含量測定用對照品穩定性欠佳且成本較高,故本研究參考文獻［14-16］,選定阿魏酸作為內標,建立洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A 和藁本內酯的相對校正因子,利用相對校正因子計算5 種成分的含量,實現一測多評。

2.5.1 色譜條件 Waters Symmetry? C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脫(0～25 min,5%～45%A；25～35 min,45%～55% A；35～45 min,55%A；45～55 min,55%～95%A；55～60 min,95%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL,理論塔板數按阿魏酸計算應不低于6 000。色譜圖見圖2。

2.5.2 對照品溶液制備 稱取適量阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯對照品,精密稱定,加甲醇制備成質量濃度分別為36.22、45.53、37.96、112.58、218.18 μg/mL的混合對照品溶液。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取川芎粉末(過4 號篩) 0.5 g,置于錐形瓶中,加入70% 甲醇50 mL,密塞,稱定質量,加熱回流30 min,放冷,再次稱定質量,用70% 甲醇補足減失質量,搖勻,靜置,取上清液,濾過,取續濾液,即得。

2.5.4 相對校正因子測定 以阿魏酸為內標,計算不同進樣量時洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A 和藁本內酯對阿魏酸的校正因子f1～f4,RSD 均小于1.5%,結果見表3。

2.5.5 方法學考察

2.5.5.1 線性關系考察 分別將混合對照品溶液稀釋2、4、8、16、20 倍,在“2.5.1” 項條件下進樣,以各對照品的峰面積為縱坐標(Y),進樣量為橫坐標(X),進行回歸,結果見表4,表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分對阿魏酸的相對校正因子（n=3）Tab.3 Relative correction factors of various constituents with reference to ferulic acid （n=3）

表4 各成分線性關系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.5.2 精密度試驗 取混合對照品溶液,在“2.5.1” 項條件下進樣6 次,每次進樣10 μL,記錄各成分峰面積。結果顯示,阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯RSD分別為1.19%、1.24%、2.13%、1.49%、2.13%,表明儀器精密度良好。

2.5.5.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液,在“2.5.1” 項條件下進樣,分別記錄0、4、8、12、2 4 h 的色譜圖。結果顯示,各阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯RSD 分別為 0.82%、1.16%、0.77%、1.58%、1.84%,表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.5.4 重復性試驗 精密稱取同一川芎樣品6份,按“2.5.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.5.1” 項條件下進樣10 μL,記錄各待測成分峰面積,計算各成分含量。結果顯示,阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯RSD 分別為1.61%、1.92%、1.88%、1.02%、1.47%,表明該方法重復性良好。

2.5.5.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的樣品粉末9 份,每3 份為一組,分別加入樣品中各成分含量的80%、100%、120%3 個水平的對照品溶液,進行供試品溶液制備,在“2.5.1” 項條件下進樣測定。結果顯示,阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯平均回收率 為 97.47%、98.91%、102.36%、99.13%、99.36%,RSD 分別為1.91%、1.79%、1.82%、1.97%、1.82%。

2.5.6 樣品含量測定 在“2.5.1” 項條件下,對28 批樣品進行含量測定,同時為了驗證一測多評法測定結果的準確性,本研究采用常規對照品作為外標法的方法和一測多評法分別測定,結果顯示2 種方法所測得的含量無明顯差異,見表5,表明樣品中阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A 和藁本內酯的含量分別為0.071%～0.197%、0.017%～0.070%、0.015%～0.039%、0.186%～0.517%、0.986%～2.157%,平均值依次為0.132%、0.034%、0.024%、0.310%、1.554%。

表5 一測多評法和外標法所得結果比較（%）Tab.5 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method （%）

2.6 質控指標差異性分析 利用GraphPad Prism 8軟件對不同等級川芎藥材的各質控指標進行差異性分析,分別計算各指標在不同等級之間的分布情況并進行單因素方差分析。見圖3,針對水分,一等品與二等品、三等品之間具有統計學差異 (P＜0.01),二等品、三等品與統貨之間具有統計學差異(P＜0.01)；在阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯A 和藁本內酯含量上,一等品與二等品、三等品及統貨間有統計學差異(P＜0.05),二等品與三等品間也有統計學差異(P＜0.05)；一等品的阿魏酸松柏酯含量與三等品有統計學差異 (P＜0.05)。

2.7 質控指標的主成分分析 參考文獻［17］,采用SIMCA-P 14.1 軟件對在不同等級川芎藥材中具有一定差異性的內在指標進行主成分分析處理,結果顯示主成分分析模型的R2X=0.77,Q2=0.51,表明該模型穩定,預測能力較強,見圖4。從中可以發現,4 個等級的川芎藥材具有一定的區分度,其中一等品與其他3 個等級藥材沿著PC1軸能明顯分開,最易辨別,CX Ⅱ-1＼ -2 和CX Ⅳ-5 也歸屬到PC1 軸右側,結合數據表明此區域為優質藥材；二等品、三等品和統貨沿著PC2 軸能明顯分開,各組內差異較小,且不同等級可以較好聚集,表明綜合上述5 種指標有利于對不同等級川芎藥材的辨別。

圖3 川芎藥材質控指標的差異性分析Fig.3 Analysis on the index level difference for the quality control of Chuanxiong Rhizoma samples

圖4 28 批樣品主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot for twenty-eight batches of samples

3 討論

中藥材作為中成藥的源頭,其質量是否均一、穩定直接影響著最終中成藥產品的質量好壞,進而影響著臨床的有效性與安全性。目前大多數中藥材及中成藥質量標準的研究仍處于對單一或少數指標成分作定性、定量質控研究,且中藥具有多組分、多靶點等特點,此質控研究模式無法全面準確反映其質量［18］,因此必須對其源頭及最終產品兩方面作質量標準提升,才能更有力的保證最終產品質量的優質穩定。

本研究結合目前市場上已有的川芎藥材分級標準［19-20］,同時參考各國法典以及國際標準,在對川芎藥材產地和市場調研的基礎上,綜合多種檢測方法對現有4 個等級川芎藥材進行檢測和比較。在對不同等級川芎藥材的各質控指標進行單因素方差分析時發現,水分、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯A 和藁本內酯含量不同等級之間均有一定差異性。進一步通過主成分分析處理后發現,4 個等級的川芎藥材具有較明顯的區分,表明川芎藥材商品等級的外觀性狀,如每千克藥材所含個數等,與內在質量之間存在一定的相關性。因此,建議主要依據川芎藥材的個數,質量等外觀形狀,并結合水分、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯A 和藁本內酯含量等內在指標對該藥材進行等級劃分。