制枳殼HPLC 指紋圖譜與小腸推動作用的譜效關(guān)系

王紅陽，鐘佩蕓，梁家怡，周敏賢，陳 康，夏 荃*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí),具有理氣寬中、行滯消脹等功效［1］,其炮制品種較多［2］。2015 年版《中國藥典》 收載了枳殼、麩炒枳殼,并將柚皮苷、新橙皮苷作為含量測定的指標(biāo)成分。

制枳殼［3］作為廣東等嶺南地區(qū)習(xí)用的炮制品種,采用了浸泡、發(fā)酵、蒸制等一系列步驟的獨(dú)特工藝,能較好地緩和生品峻烈之性,避免損氣、耗氣之弊,在當(dāng)?shù)貜V泛應(yīng)用。但目前對制枳殼的研究較少,僅涉及炮制前后其化學(xué)成分變化,盡管有學(xué)者對其指紋圖譜進(jìn)行了研究［4］,但尚未涉及其藥效及物質(zhì)基礎(chǔ),存在成分變化與藥效研究分離的問題。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),枳殼經(jīng)發(fā)酵、蒸制后,柚皮苷、新橙皮苷、揮發(fā)油等藥效成分含量均有所降低［5］,但臨床療效依舊顯著,故推測炮制品發(fā)揮藥效的主要成分可能與生品不同,其藥效評價及物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步考察。

灰色關(guān)聯(lián)分析［6-7］是目前譜效關(guān)系研究中應(yīng)用較廣泛的方法,但存在易受分辨系數(shù)影響的缺點(diǎn),并且不能反映相關(guān)的正負(fù)性,故實(shí)際分析時很多學(xué)者更趨向于采用2 種及2 種以上方法聯(lián)合應(yīng)用［8］。正交投影偏最小二乘法(OPLS)［9］是一種改進(jìn)的偏最小二乘法,在分析多因素模型時能有效去除預(yù)測矩陣中與因變量無關(guān)的信息,改善了模型的解釋性和真實(shí)性,被廣泛應(yīng)用于模型驗(yàn)證,可很好地彌補(bǔ)灰色關(guān)聯(lián)度分析方法的不足。因此,本實(shí)驗(yàn)在建立生、制枳殼指紋圖譜的基礎(chǔ)上,通過聯(lián)合應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)分析與OPLS 進(jìn)行譜-效關(guān)聯(lián),旨在探討制枳殼小腸推動作用的藥效物質(zhì),為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20A 高效液相色譜系統(tǒng)、Inertsil ODS-3 高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) (日本島津公司)；Triple TOF 5600 超高效液相色譜儀-飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司)。

1.2 試劑橙皮苷 (110721-201617,20 mg,純度96.1%)、柚皮苷(110722-201714,20 mg,純度93.4%)、新橙皮苷(111857-201703,20 mg,純度99.2%) 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮素(BWB50920,20 mg,純度≥98%)、橙皮素(BWB50172,20 mg,純度≥98%)、川陳皮素(BWB0620,20 mg,純度≥98%) 對照品均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。枸櫞酸莫沙必利分散片(180902) 購自成都康弘藥業(yè)集團(tuán)有限股份公司。甲醇、乙腈為色譜純(德國默克公司)；其他試劑均為分析純。

1.3 藥物 枳殼經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定為酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí),具體信息見表1。制枳殼制備方法為將生品(編號S1～S10) 除去雜質(zhì)及瓢核,洗凈,浸至七成透,取出,發(fā)酵3～4 d,洗凈,蒸4～6 h,悶一夜,至內(nèi)部呈紫褐色時取出,切片,干燥,即得,編號S11～S20［3］。

表1 樣品信息

1.4 動物 264 只SPF 級昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2) g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物合格證號44005800006682,動物實(shí)驗(yàn)許可證號SYXK(粵) 2013-0085。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陳皮素對照品適量,加甲醇制成每1 mL 分別含上述成分80 μg 的溶液,即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品粗粉約1 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入90 mL 甲醇,稱定質(zhì)量,加熱回流1.5 h,放冷,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.1.3 色譜條件 參考文獻(xiàn)［10］ 報道。Inertsil ODS-3 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -水(含0.1%磷酸) (B),梯度洗脫(0～10 min,5%～6%A；10～20 min,6%～15% A；20～75 min,15%～27% A；75～120 min,27%～65% A)；體 積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長283 nm。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧ESI 離子源,負(fù)離子模式掃描；檢測范圍50～1 200 Da；噴霧電壓5 500 eV；離子源溫度550 ℃；去簇電壓100 V；二級碰撞電壓±45 V。

2.1.5 圖譜生成 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,將10 批樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)” (2008A 版),以S6 為參照,采用平均數(shù)法得到指紋圖譜及對照指紋圖譜,見圖2～3,發(fā)現(xiàn)各批樣品相似度均＞0.95,表明其質(zhì)量穩(wěn)定。

圖2 生枳殼指紋圖譜、對照圖譜

圖3 制枳殼指紋圖譜、對照圖譜

2.1.6 方法學(xué)考察 取供試品溶液(S10),在“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6 次,測得各共有峰相對峰面積RSD 均＜3%,表明儀器精密度良好。按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份,在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測得各共有峰相對峰面積RSD 均＜3%,表明該方法重復(fù)性良好。按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得各共有峰相對峰面積RSD 均＜3%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 HPLC-Q-TOF-MS 數(shù)據(jù)采集 見圖4。

圖4 樣品總離子流圖（正離子）

2.2 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥液制備 取生、制枳殼各500 g,加10 倍量水浸泡30 min,煎煮30 min,紗布過濾,殘渣加8 倍量水煎煮20 min,合并水煎液,減壓抽濾,將濾液濃縮至生藥量1 g/mL,即得。

2.2.2 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后,隨機(jī)分為22 組,每組12 只,分別為空白組、陽性組(10 mg/kg 枸櫞酸莫沙必利)、10 個生枳殼組(4 g/kg)、10 個制枳殼組(4 g/kg)。給藥組按0.2 mL/10 g 劑量灌胃,空白組灌胃給予相應(yīng)體積蒸餾水,每天1 次,連續(xù)4 d。

2.2.3 小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 小鼠末次給藥前禁食不禁水14 h,末次給藥1 h 后灌胃給予營養(yǎng)性半固體糊,每只0.6 mL,5 min后脫頸處死,分離腸胃,測量幽門到盲腸部全長及半固體糊推進(jìn)前沿的距離,計算小腸推進(jìn)率,公式為推進(jìn)率=(幽門到指示前沿距離/幽門至回盲腸全部距離) ×100%［11］,通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以()表示,組間比較采用單因素方差分析,結(jié)果見表2。由此可知,與空白組比較,生、制枳殼組對小鼠小腸推進(jìn)能力均有不同程度的促進(jìn)作用(P＜0.05),但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 生、制枳殼對小鼠小腸推進(jìn)能力的影響（）

表2 生、制枳殼對小鼠小腸推進(jìn)能力的影響（）

注:與空白組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.3 灰色關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 數(shù)據(jù)無量綱化處理 采用DPS7.05 軟件,原始數(shù)據(jù)采用初值化變換法。以小腸推進(jìn)率的藥效指標(biāo)為母序列,記為｛X0(t) ｝；生、制枳殼特征峰的峰面積作為子序列,記為｛Xi(t) ｝。

2.3.2 絕對差序列、關(guān)聯(lián)系數(shù)計算 經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母序列標(biāo)記為｛X0(k) ｝,子序列記為｛Xi(k) ｝,k=t時兩者關(guān)聯(lián)系數(shù)L0i(k) 可由以下公式計算。其中,Δ0i(t) 表示2 個比較序列的絕對差,即Δ0i(t)=｜x0(t) -xi(t) ｜(1≤i≤m)；Δmin、Δmax分別表示所有比較序列各時間點(diǎn)絕對差中的最小值、最大值；ρ為分辨系數(shù),通常取0.5。

2.3.3 關(guān)聯(lián)度計算 按下式計算各比較序列與參考序列關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值,以反映兩者關(guān)聯(lián)關(guān)系。其中,r0i為子序列與母序列的關(guān)聯(lián)度,n為子序列的長度即數(shù)據(jù)個數(shù)。

2.4 藥效高相關(guān)色譜峰指認(rèn) 通過Peakview、Markerview 軟件對UPLC-Q-TOF-MS 數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,基于文獻(xiàn)研究和chemspider、HMD 公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分分析,結(jié)果見表3～4。

2.5 偏最小二乘法（OPLS-DA） 判別分析

2.5.1 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 采用SIMCA-P14.1 軟件,分別將表2、4 中的色譜峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表3 小腸推動作用與生枳殼色譜峰峰面積的相關(guān)度（關(guān)聯(lián)系數(shù)＞0.75）

表4 小腸推動作用與制枳殼色譜峰峰面積的相關(guān)度（關(guān)聯(lián)系數(shù)＞0.75）

2.5.2 生枳殼譜效關(guān)系的OPLS-DA 分析 以標(biāo)準(zhǔn)化處理的特征峰峰面積為自變量X,各組小鼠小腸推進(jìn)率為因變量Y1,采用SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行OPLS 回歸分析,見圖5～6。由此可知,X5(新圣草苷)、X8(蕓香柚皮苷)、X3的VIP 值均＞1,其中X5、X8均為正值,表明兩者與小腸推進(jìn)率呈高度正相關(guān)性。

圖5 生枳殼譜效相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)

圖6 生枳殼各藥效相關(guān)峰對小腸推動作用的貢獻(xiàn)

2.5.3 制枳殼譜效關(guān)系的(OPLS-DA) 分析 以標(biāo)準(zhǔn)化處理特征峰峰面積為自變量X,各組小鼠小腸推進(jìn)率為因變量Y2,采用SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行OPLS 回歸分析,見圖7～8。由此可知,X3(柚皮黃素)、X15(傘形花內(nèi)酯)、X16(異牡荊素)、X17(新圣草苷)、X19、X26均與小腸推進(jìn)率呈正相關(guān),其中X3、X15的VIP 值均＞1,表明兩者為制枳殼主要活性成分。

圖7 制枳殼譜效相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)

圖8 制枳殼各藥效相關(guān)峰對小腸推動作用的貢獻(xiàn)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),制枳殼藥效高相關(guān)成分明顯多于生枳殼,而且種類存在較大差異。生枳殼中橙皮苷、新圣草苷、新橙皮苷與藥效呈正向高相關(guān)性,與目前發(fā)現(xiàn)的促胃腸動力主要成分基本一致［12-14］,說明所建立譜效關(guān)系可靠。

在制枳殼的OPLS 模型中,柚皮素、新橙皮素與藥效表現(xiàn)出高度正相關(guān)性,而部分苷類,尤其是橙皮苷、新橙皮苷則與表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。其原因可能為(1) 柚皮苷、新橙皮苷是枳殼中含量較高的黃酮類成分,兩者均含有分子量較大的雙糖結(jié)構(gòu),親脂性低,在消化道內(nèi)不易被吸收［15］,從生物利用度和活性來講,黃酮苷類的生物活性低于對應(yīng)的苷元；(2) 制枳殼在發(fā)酵過程中柚皮苷、橙皮苷在微生物群的作用下水解,含量降低,同時脫去糖基轉(zhuǎn)化成柚皮素、新橙皮素等苷元,使得對應(yīng)苷元含量明顯升高,而苷元脂溶性較大,有利于經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán),能較快達(dá)到所需血藥濃度,并發(fā)揮其藥效作用。

胃腸運(yùn)動同時受到神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌激素的調(diào)控,是極為復(fù)雜、高度協(xié)調(diào)的神經(jīng)-肌肉活動［16］。本研究發(fā)現(xiàn),生、制枳殼雖然在藥效相關(guān)性成分上差異明顯,但兩者對正常小鼠的促小腸推動作用并無顯著差異,提示它們可能有不同的促小腸運(yùn)動作用機(jī)制。對慢性胃腸功能障礙的患者而言,糖苷類成分可能更難以被吸收利用,而制枳殼中黃酮苷元有更好的生物利用度,從而療效更強(qiáng),可能是臨床上以其組方治療脾虛體弱患者的原因。因此,需建立相應(yīng)的病理狀態(tài)動物模型或進(jìn)行臨床研究,從多個角度進(jìn)行更深入的探討,并且枳殼炮制后的作用表現(xiàn)在多個方面,如緩和烈性與燥性等,有待進(jìn)一步探討。

雖然制枳殼作為嶺南地區(qū)習(xí)用藥被廣泛使用,但廣東省中藥飲片炮制規(guī)范尚未建立其含量測定的方法及標(biāo)準(zhǔn),不利于質(zhì)量控制及評價。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),制枳殼胃腸推動藥效成分遠(yuǎn)多于生枳殼,而且種類不同,故以柚皮苷、新橙皮苷等2015 年版《中國藥典》 規(guī)定的指標(biāo)成分對制枳殼質(zhì)量進(jìn)行評價不夠合適。今后,可從制枳殼未知藥效相關(guān)成分的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及藥效評價入手,為該炮制品物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制的研究奠定基礎(chǔ)。