五味子甲素對潰瘍性結腸炎大鼠的保護作用

劉永生 王金菊

(河南省中醫院， 河南 鄭州450002）

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC) 是一種常見的慢性腸道非特異性炎癥,好發于左半結腸及直腸,可累及整個結腸,病變主要局限在黏膜和黏膜下層［1］,以腹瀉、腹痛、黏液膿血便為主要臨床癥狀。該病給藥難度大、可反復發作,病程可多達幾十年甚至伴隨終生,是世界衛生組織公認的難治性疾病［2］。此外,研究表明,該病可增加結腸癌的發病風險,降低了患者的生活質量［3-4］。由于該病的發病機制尚未完全明確,目前普遍認為炎癥因子過度表達與免疫功能低下可能是其發病的主要原因,并與遺傳、環境和微生物感染等其他因素共同作用有關,臨床給藥仍以水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑等化學藥為主,但化學藥長期使用的毒副作用較大,且患者的病情遷延不愈,導致出現較多停藥現象。五味子甲素是從五味子果實中分離出來的具有生物活性的木脂素,研究表明五味子甲素具有抗炎、抗自由基［5］、保肝及抑制胃腸平滑肌痙攣［6］等作用。本研究探討五味子甲素對大鼠潰瘍性結腸炎的保護作用,并且進一步探討其作用機制,以期為進一步臨床開發應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 50 只SPF 級SD 大鼠,雌雄各半,體質量(200±20) g,由河南省實驗動物中心提供,使用許可證號SYXK (豫) 2018-0014。大鼠給予標準顆粒飼料,自由飲用純凈水。恒溫動物室的溫度為(25±2)℃,相對濕度為(50±10)%,每小時通風換氣8 次,光照隨晝夜浮動。實驗開始前所有大鼠均適應性飼養1 周。

1.2 藥物與試劑 五味子甲素,批號61281-38-7,純度為98.8%,購自南京道斯夫生物科技有限公司；美沙拉嗪(批號201803),購自牡丹江恒遠藥業股份有限公司,國藥準字H20066027,純度為99.3%；三硝基苯磺酸,購自美國Sigma 公司；無水乙醇,購自上海凌峰化學試劑有限公司；干擾素-6 (interleukin-6,IL-6) 和干擾素-10 (interleukin-10,IL-10) 試劑盒,購自福州邁新生物技術開發有限公司；轉化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1),購自北京百諾威生物科技有限公司；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF) -α 試劑盒,購自北京欣博盛生物科技有限公司；Toll 樣受體4 (toll like receptor 4,TLR4)、核轉錄因子(nuclear factor,NF) -κB p65、p-NFκB p65、NF-κB 抑制蛋白-α (inhibitor of NF-κB-α,IκBα)、p-IκB-α 抗體,購自美國Cell Signaling Technology 公司；RIPA 裂解液、β-肌動蛋白(β-actin) 抗體、HRP-羊抗大鼠IgG 二抗和ECL Prime 蛋白印跡試劑,購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器 T323S 型電子天平,購自德國Sartorius 公司；EXL808 全自動酶標儀,購自美國Bio-Tek 公司；MSD97K49型微量離心機,購自美國Beckman 公司；DNM-9602G 自動酶標儀,購自美國Bio-Tek 公司；蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、化學發光掃描儀,均購自美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 造模、分組和給藥 隨機選取8 只SD 大鼠作為正常對照組,自由飲用純凈水；其余42 只SD 大鼠采用三硝基苯磺酸/乙醇法造模。所有大鼠禁食不禁水24 h,采用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 進行腹腔麻醉,將5%三硝基苯磺酸+50% 乙醇吸入注射器后連接一次性靜脈輸液針(2 mm) 并剪去針頭,插入肛門上段約8 cm,以0.02 mL/kg的劑量緩慢注入5%三硝基苯磺酸+50%乙醇,輕揉大鼠腹部l min。正常對照組大鼠除了用生理鹽水替代5%三硝基苯磺酸+50%乙醇溶液進行灌腸外,其他操作同造模大鼠。

造模后除正常對照組外,其他大鼠均出現腹瀉、黏液膿血便、進食減少等現象,造模后第4 天隨機選擇2 只大鼠脫臼處死,尸檢顯示結腸膜出現充血、水腫并伴有潰瘍形成,則提示建模成功。

將造模大鼠隨機分為模型對照組、美沙拉嗪組及五味子甲素高劑量組、中劑量和低劑量組,每組均為8 只。造模后第5 天各組開始給藥,五味子甲素高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠分別灌胃給予五味子甲素80、40、20 mg/kg,美沙拉嗪組大鼠灌胃給予美沙拉嗪0.4 g/kg,模型對照組和正常對照組大鼠分別灌胃給予同體積的生理鹽水。各組給藥時間均為2 周。

2.2 疾病活動指數的測定 實驗開始時每天觀察動物的體質量、腹瀉和大便性狀等。按照Cooper 等［7］評分標準評估各組在給藥前、給藥1 周和給藥2 周時大鼠疾病活動指數(disease activity index,DAI) 的變化,DAI=(體質量降低評分+大便形狀評分+血便評分)/3。具體評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準

2.3 血清促炎和抑炎因子水平的測定 各組大鼠于給藥前、給藥1 周和2 周時尾靜脈取血各約0.5 mL,室溫下靜置30 min,待血液完全凝固后低溫離心后分離得血清,采用酶聯免疫吸附(ELISA) 法測定血清IL-6、IL-10、TGFβ1 和TNF-α 水平,操作時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.4 腸道黏膜通透性實驗 各組大鼠給藥2 周末給藥后禁食不禁水24 h,分別灌胃給予2 mL 乳果糖(lactose,L)和甘露醇(mannitol,M) 混合液(其中含5%乳果糖和2%甘露醇),將各組大鼠置于代謝籠,收集24 h 內尿液,離心,取10 mL 尿液加2 mL 硫柳汞防腐,于-70 ℃貯存待測。采用高壓液相色譜分析法測定乳果糖和甘露醇水平,計算L/M 以評估各組大鼠腸道黏膜通透性。

2.5 結腸組織病理學評分 腸道黏膜通透性實驗結束后各組大鼠腔注射10%水合氯醛(0.25 mL/100 g) 進行麻醉,麻醉后分離結腸,留取距肛門2 cm 至回盲部結腸標本,用生理鹽水沖洗結腸,取1 cm 用于組織病理學檢測,其余組織于-80 ℃保存待用。用磷酸鹽緩沖液將結腸組織沖洗干凈后置于多聚甲醛溶液(40 g/L) 固定,常規石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE) 染色,采用光學顯微鏡觀察結腸組織切片,以Dieleman 的標準［8］進行組織病理學評分,正常黏膜,評分為0；基底隱窩缺損＜1/3,評分為1；基底隱窩缺損≥2/3,評分為2；隱窩缺失,僅余表面上皮,伴炎細胞浸潤,評分為3；黏膜糜爛、潰瘍伴大量炎細胞浸潤,評分為4～5。

2.6 蛋白免疫印跡實驗 取各組結腸組織適量充分研磨,加入RIPA 裂解液,冰上裂解30 min,離心(14 000×g)15 min,收集上清,二喹啉甲酸(BCA) 法測定細胞總蛋白濃度,并將濃度調整至一致。各孔取40 μg 蛋白上樣,于15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10% 分離膠和5%濃縮膠) 電泳進行蛋白分離 (電壓 100 V,2～

2.5 min),采用電轉法(300 mA 電流60～90 min) 將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜,5%脫脂奶粉封閉1 h。用TBST 洗膜,加入一抗孵育4 ℃反應過夜。次日先以TBST 洗膜,加入二抗孵育,室溫反應1 h,再用TBST 洗膜,增強化學發光法顯色,全自動凝膠成像儀采集圖片。采用Image J 圖像分析管理系統對蛋白條帶灰度值進行分析,以TRL4、p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65 與內參β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.7 統計學分析 使用SPSS22.0 軟件進行分析,計量數據均通過正態性檢驗,以() 描述；多組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復觀測資料則行重復測量方差分析,兩兩組間比較采用LSD-t檢驗,兩兩時間比較采用差值t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠給藥前后DAI 評分的比較 給藥前除正常對照組外,其他各組大鼠DAI 評分無差異(P＞0.05),并且均較正常對照組升高(P＜0.01)。給藥1 周和2 周時五味子甲素高劑量組大鼠DAI 評分較中劑量組和小劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠DAI 評分較低劑量組降低(P＜0.05),模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠DAI 評分無差異(P＞0.05)；給藥1 周和2 周時美沙拉嗪組大鼠DAI 評分較模型對照組降低(P＜0.05)。見表2。

3.2 各組大鼠給藥前后血清炎癥因子水平的比較 給藥前除正常對照組外,其他各組大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-10和TNF-α 水平無差異(P＞0.05)；模型對照組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較正常對照組升高,TGF-β1 和IL-10 水平較正常對照組降低(P＜0.01)。給藥1 周和2 周時五味子甲素高劑量組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較中劑量組和小劑量組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較中劑量組和小劑量組升高(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較低劑量組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較低劑量組升高(P＜0.05)；而模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠TGF-β1、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平 無差 異 (P＞0.05)。給藥1 周和2 周時美沙拉嗪組大鼠血清IL-6 和TNF-α 水平較模型對照組降低,TGF-β1 和IL-10 水平較模型對照組升高(P＜0.05)。見表3～4。

表2 各組大鼠給藥前后DAI 評分（分，， n=8）

表2 各組大鼠給藥前后DAI 評分（分，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

表3 各組大鼠給藥前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）

表3 各組大鼠給藥前后血清TGF-β1 和IL-6 水平（pg/mL，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

表4 各組大鼠給藥前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）

表4 各組大鼠給藥前后血清IL-10 和TNF-α 水平（pg/mL，， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

3.3 各組大鼠腸道通透性的比較 給藥2 周時模型對照組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較正常對照組升高,甘露醇較正常對照組降低(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值均較中劑量組和小劑量組降低,甘露醇較中劑量組和小劑量組升高(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較低劑量組降低,甘露醇較低劑量組升(P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠尿液中乳果糖、甘露醇、L/M 比值無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠尿液中乳果糖、L/M 比值較模型對照組降低,甘露醇較模型對照組升高 (P＜0.05)。見表5。

表5 各組大鼠給藥2 周時腸道通透性和結腸組織病理學評分（， n=8）

表5 各組大鼠給藥2 周時腸道通透性和結腸組織病理學評分（， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

3.4 各組大鼠給藥2 周時結腸組織病理學評分的比較 給藥2 周時模型對照組大鼠結腸病理學評分較正常對照組升(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠結腸組織病理學評分均較中劑量組和小劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠結腸組織病理學評分較低劑量組降低 (P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠結腸組織病理學評分無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠結腸組織病理學評分較模型對照組降低(P＜0.05)。見表5。

3.5 各組大鼠給藥2 周時結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白 給藥2 周時模型對照組大鼠結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均正常對照組升高(P＜0.01)；五味子甲素高劑量組大鼠結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均較中劑量組和低劑量組降低(P＜0.05)；五味子甲素中劑量組大鼠結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白均較 低劑量組降低 (P＜0.05)；模型對照組和五味子甲素低劑量組大鼠結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白無差異(P＞0.05)；美沙拉嗪組大鼠結腸組織TLR4、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白較模型對照組降低(P＜0.05)。見表6。

表6 各組大鼠結腸組織中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表達（， n=8）

表6 各組大鼠結腸組織中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α 和p-IκB-α 蛋白表達（， n=8）

注:與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型對照組比較,bP＜0.05；與五味子甲素低劑量組比較,cP＜0.05；與五味子甲素中劑量組比較,dP＜0.05。

4 討論

傳統中醫藥講究論本而治,五味子甲素為五味子果實主要活性物質之一。已有研究［9］顯示,五味子甲素對三硝基苯磺酸誘導的小鼠潰瘍性結腸炎有給藥作用,作用機制可能與其抑制炎癥因子NO、IL-6 及TNF-α 的產生有關。

本研究采用五味子甲素對大鼠實驗性結腸炎的保護作用及機制進行進一步研究,結果顯示,五味子甲素給藥1周和2 周時可劑量依賴性降低大鼠DAI 評分,且給藥2 周時可劑量依賴性降低結腸組織病理學評分,說明五味子甲素對大鼠實驗性結腸炎具有保護作用。

腸道黏膜在多種危險因素刺激下上皮屏障破壞,會導致腸組織的慢性炎癥性反應而發生潰瘍性結腸炎［10］。IL-6具有廣泛生物活性的促炎細胞因子［11］。TGF-β 是生長因子超家族中具有免疫負調控功能的一大類細胞因子家族［12］。IL-10 維持腸道正常黏膜免疫平衡。TNF-α 參與潰瘍性結腸炎的炎癥反應和免疫應答。本研究結果顯示,五味子甲素給藥1 周和2 周時可劑量依賴性降低大鼠血清IL-6 和TNFα 水平,升高大鼠血清TGF-β1 和IL-10 水平,說明五味子甲素對大鼠實驗性結腸炎的保護作用可能與其降低促炎細胞因子IL-6 和TNF-α,升高抑炎細胞因子TGF-β1 和IL-10有關。

目前研究顯示,潰瘍性結腸炎的發病機制可能與腸道黏膜屏障功能減弱有關［13-14］。L/M 值可間接且全面、準確地反映腸黏膜的通透性變化,L/M 值增大,說明潰瘍性結腸炎腸通透性增高,腸屏障功能損害［15］。本研究結果顯示,五味子甲素給藥2 周時可劑量依賴性大鼠尿液中L/M比值,說明五味子甲素可降低大鼠腸道黏膜通透性,這可能是其發揮潰瘍性結腸炎保護作用的機制。

NF-κB 是各種致病因子釋放和表達的關鍵［16-17］,后續產生級聯炎癥反應,使炎癥過程得以放大和持續,從而損傷腸黏膜,最終導致潰瘍性結腸炎的發生［18］。目前已知NF-κB 的活化是潰瘍性結腸炎發生發展的關鍵因素之一［19］。本研究結果顯示,五味子甲素給藥2 周時可劑量依賴性降低潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中蛋白表達水平,說明五味子甲素對大鼠潰瘍組織TLR4/NF-κB 信號通路具有抑制作用,這可能是其發揮潰瘍性結腸炎保護作用的機制。

五味子甲素對潰瘍性結腸炎大鼠具有保護作用,可能與調控血清促炎和抑炎細胞水平,降低腸道黏膜通透性及抑制結腸組織中TLR4/NF-κB 信號通路有關。