GC-MS 法測定白芍總苷原料藥中22 種有機氯類農藥殘留量

沈君子，武曉劍，殷 紅，陳永建，馬長雨，錢 勇

(1.上海佰年詩丹德檢測技術有限公司，上海 201314；2.寧波立華制藥有限公司，浙江 寧波 315174；3.上海詩丹德標準技術服務有限公司，上海 201314；4.國家中藥現代化工程技術研究中心中藥標準分中心，上海 201314）

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根。夏、秋二季采挖,洗凈,除去頭尾和細根,置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮,曬干。白芍具養血調經、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功能。用于血虛萎黃、月經不調、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛、頭痛眩暈［1］。白芍在種植過程中易感染多種病蟲害且發病率高,濫用農藥造成了白芍的直接污染,此外,白芍生長周期長(一般3～4 年［2］),土壤和空氣中殘留的農藥容易在植物組織中富集,又會對白芍產生間接污染［3］。杜雪純等［4］通過CE-MS 建立了一種測試白芍中19 種有機氮類農藥殘留的方法。程玲等［5］通過大體積進樣-氣相色譜-質譜聯用方法建立了一種測試白芍中有機氯、有機磷和擬除蟲菊酯類等15種農藥殘留的方法。劉小勤等［6］建立的SPE 凈化和GCQqQ-MS 相結合的檢測方法適用于白芍中多農藥殘留的同時篩查測定。

隨著我國藥品標準提高計劃的實施和不斷推進,國家藥品標準體系已初步建立,藥品監管信息化建設步伐加快,藥品標準管理工作更加趨于規范和完善。但中藥提取物標準化工作仍顯得相對滯后。白芍總苷原料藥,是寧波立華制藥有限公司將白芍飲片經過乙醇提取,乙酸乙酯、正丁醇萃取后得到的白芍濃縮干燥粉末［7］。浦錦寶等［8］對白芍總苷原料藥中芍藥苷及總皂苷的含量研究發現,其中芍藥苷含量均大于15%,總皂苷的含量均大于60%。賀妮等［9］研究發現白芍總苷原料藥對小鼠有抗抑郁及抗炎作用,可能通過影響中樞單胺神經功能對抑郁及炎癥進行調節。楊德芳等［10］研究發現當歸/白芍組提取物可通過抑制子宮收縮,改善子宮供血,從而對原發性痛經產生治療作用。目前針對白芍中農藥殘留的報道較多,尚未見有關白芍總苷原料藥測試農藥殘留方面的資料。白芍總苷原料藥中主要成分為皂苷類,極性大,如參考常規藥材前處理方法用酸水浸泡或乙腈等極性較大的溶劑對農藥殘留進行提取,會將皂苷類成分同時萃取出來,干擾農藥殘留的檢測。本實驗采用甲苯提取、硅膠凈化,建立GC-MS 法測定白芍總苷原料藥中22 種有機氯類農藥的殘留量,以期為白芍總苷原料藥標準制訂和質量控制提供依據。

1 材料

Agilent 7890A/5977AGC-MS 聯用儀 (美國安捷倫公司)；FA2004 電子天平、XS205 電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；L500 離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；氮吹儀 (美國Organomation Assoc.INC 公司)；W2-100SP 恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；Vortex Genins3 渦旋振蕩器(德國IKA 公司)。

農藥對照品α-六六六、六氯苯、β-六六六、γ-六六六、五氯硝基苯、δ-六六六、七氯、艾氏劑、氧化氯丹、順式環氧七氯、反式環氧七氯、反式氯丹、β-硫丹、順式氯丹、4,4′-滴滴伊、狄氏劑、異狄氏劑、α-硫丹、4,4′-滴滴滴、2,4′-滴滴涕、4,4′-滴滴涕、硫丹硫酸鹽(上海安譜實驗科技股份有限公司)。白芍總苷原料藥(批號171209,寧波立華制藥有限公司)。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 稱取22 種對照品10 mg,精密稱定,置于10 mL 量瓶中,用丙酮溶解并定容至刻度,配置成1 mg/mL貯備液；取100 μL 貯備液,用丙酮定容至10 mL,制備成質量濃度為10 μg/mL 的溶液,取1 mL,用丙酮稀釋至10 mL,得1 μg/mL 混合對照品溶液。

2.1.2 基質標準曲線溶液 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,置15 mL 具塞離心管中,加入10 mL 甲苯,分別加入混合 對照品溶 液10、20、40、100、200、400、800 μL,超聲20 min,4 000 r/min,離心5 min,取上清液至15 mL離心管中,加入無水硫酸鎂900 mg,硅膠300 mg,渦旋1 min,4 000 r/min,離心5 min,取上清液,置于40 ℃水浴中氮吹至干,加入甲苯2 mL 定容,經0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液即得。

2.2 供試品溶液 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,置15 mL 具塞離心管中,加入10 mL 甲苯,超聲20 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液至15 mL 離心管中,加入無水硫酸鎂900 mg,硅膠300 mg,渦旋1 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液,置于40 ℃水浴中氮吹至干,加入甲苯2 mL 定容,經0.45 μm 微孔濾膜過濾,取濾液即得。

2.3 色譜條件 HP-5MS 色譜柱 (30 m × 0.25 mm,0.25 μm)；程序升溫(60 ℃維持2 min,以16 ℃/min 升至150 ℃維持0 min,以10 ℃/min 升至200 ℃維持0 min,以3 ℃/min 升至220 ℃維持0 min,以25 ℃/min 升至290 ℃維持8 min)；進樣口溫度250 ℃；進樣量1 μL；載氣體積流量1 mL/min；分流模式不分流。

2.4 質譜條件 離子源電子轟擊源(EI)；離子源溫度230 ℃；質譜傳接口溫度280 ℃；質譜監測模式SIM,監測離子結果見表1。

表1 22 種有機氯類農藥殘留質譜監測離子結果

2.5 結果計算 基質標準曲線外標法。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 取“2.1.2” 項下基質標準曲線溶液,在“2.3” “2.4” 條件下測定,以信號強度為縱坐標(Y),質量濃度為橫坐標(X) 進行回歸,結果見表2,表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 22 種有機氯類農藥殘留線性關系

2.6.2 精密度試驗 考察不同日期、不同分析人員對精密度的影響,2 個檢測人員對重復性下濃度的各6 份平行進行檢測,RSD 6%～19%,均不大于32%,表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 藥材粉碎過3 號篩,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液；在“2.3” “2.4” 條件下測定,22種農藥RSD 為5%～13%,表明該方法重復性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗 提取物直接取樣,稱取供試品2 g,稱定,按 “2.1” 項下方法制備供試品溶液；在“2.3” “2.4” 條件下測定,計算每種農藥的平均回收率,結果見表3。

2.6.5 定量限 在“2.3” “2.4” 條件下,把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較,計算出能被可靠地檢測出的被測物質最低濃度,制備估算濃度的加標樣品6 份,考察定量限濃度下的準確度和精密度,結果見表3,每種農藥的定量限未超過2015 年版《中國藥典》 四部通則2341 第二法規定限值。

表3 22 種有機氯類農藥殘留在白芍總苷原料藥中的定量限

2.6.6 耐用性考察

2.6.6.1 不同填料對方法耐用性的影響 準備無水硫酸鎂900 mg、硅膠300 mg 至15 mL 具塞離心管中；無水硫酸鎂900 mg 至另一支10 mL 具塞離心管中；市售農殘凈化管,分別加入6 mL 甲苯、農殘混合對照品100 μL,渦旋1 min,4 000 r/min 離心5 min,取上清液,置氮吹儀上40 ℃水浴氮吹至干,加甲苯1 mL,渦旋混勻,經0.22 μm 微孔濾膜過濾,取濾液即得,在“2.3” “2.4” 條件下檢測；比對市售農殘凈化管、無水硫酸鎂+硅膠、無水硫酸鎂的回收率,考察填料不同對方法的影響。結果見表4,表明單獨使用無水硫酸鎂無法很好凈化白芍藥材基質對于農藥的干擾,農殘凈化管與無水硫酸鎂+硅膠的凈化效果相當。

2.6.6.2 對照品溶液穩定性 制備混合對照品溶液,分別考察在2、4、6、10、14、17、30 h 內離子豐度變化；以2 h為對照,核查不同時間內的回收率,在85%～115%范圍內判斷為符合驗收標準。結果顯示,除艾氏劑在30 h 時,回收率降低至82%,其余化合物在30 h 內基本穩定。

2.6.6.3 供試品溶液穩定性 空白樣品被證實22 種農藥殘留均低于檢出限,因此改為考察加標供試品溶液的穩定性。制備藥材加標溶液,分別考察在2、4、6、10、14、17、30 h 內離子豐度變化；以0 h 為對照,核查不同時間內的回收率,在85%～115% 范圍內判斷為符合驗收標準。結果顯示,供試品溶液中4,4′-滴滴涕從2 h 開始回收率降低、β-硫丹第6 h 開始回收率不穩定、異狄氏劑第17 h 開始回收率不穩定,其余化合物基本符合要求；建議供試品溶液制備2 h 內完成檢測。

表4 不同填料對方法耐用性的影響

2.6.6.4 載氣體積流量 將設備載氣體積流量分別設置為0.8、1.2 mL/min,其他參數不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農藥,考察回收率,在85%～115%范圍內判斷為符合驗收標準。0.8～1.2 mL/min 的體積流量對加標供試品溶液中五氯硝基苯、六氯苯無影響,見表5。

表5 不同載氣體積流量、初始柱溫、進樣口溫度對方法耐用性的影響

2.6.6.5 初始柱溫 將設備初始柱溫分別設置為50、70 ℃,其他參數不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農藥,考察回收率,在85%～115%范圍內判斷為符合驗收標準。不同初始柱溫對加標供試品溶液中五氯硝基苯基本無影響,當初始柱溫設置為50 ℃時,對藥材加標溶液中六氯苯的回收無影響；當初始柱溫設置為70 ℃時,六氯苯無回收,見表5。

2.6.6.6 進樣口溫度 將設備進樣口溫度分別設置為240、260 ℃,其他參數不變,選擇五氯硝基苯和六氯苯作為代表農藥,考察回收率,在85%～115%范圍內判斷為符合驗收標準。不同進樣口溫度對加標供試品溶液中五氯硝基苯、六氯苯基本無影響,見表5。

3 討論

白芍總苷原料藥制備過程中使用到乙醇、正丁醇、乙酸乙酯,為了減少基質干擾,會避免用該3 種溶劑對樣品進行處理,參考文獻［11］ 中方法,最終用甲苯作為提取溶劑。

比較固相萃取凈化管、無水硫酸鎂+硅膠、無水硫酸鎂等不同填料對22 種有機氯類農藥殘留的凈化效果,發現單獨使用無水硫酸鎂無法很好凈化白芍藥材基質對于農藥的干擾,農殘凈化管的凈化效果雖然與無水硫酸鎂+硅膠相當,但大部分的農藥回收率低于無水硫酸鎂+硅膠做出來的回收率,這與農殘凈化管中多種填料在一起,可能對目標成分產生抑制作用有關。農藥殘留分析過程中的前處理是整個分析的關鍵所在,目前用的較多的為凝膠滲透色譜法,該方法可除去供試品溶液基質中的大分子干擾物,適用于更多種復雜基質,但成本較高,本方法采用靜態吸附去雜方法,成本低,操作簡易,且凈化效果好。

本研究比較了不同載氣體積流量、柱溫、進樣口溫度對方法耐用性的影響,發現不同載氣體積流量及不同進樣口溫度對五氯硝基苯及六氯苯的回收率無影響,降低初始柱溫對五氯硝基苯及六氯苯的回收率無影響,當初始柱溫升高至70 ℃時,六氯苯無回收,初始柱溫不能設置過高。

本研究用甲苯進行提取,硅膠及無水硫酸鎂填料對提取溶液進行凈化,結合GC-MS 進行檢測,建立了白芍總苷原料藥中22 種有機氯類農藥殘留同時檢測的分析方法。采用基質標準曲線外標法定量對基質效應進行一定的補償。該方法操作簡易、準確可靠、靈敏度高,可用于白芍總苷原料藥中22 種農藥殘留的同時測定,對于富含皂苷類成分的其他中藥及中藥提取物的農殘檢測具有借鑒作用。