夾心酶聯免疫吸附試驗法與PCR 法對檢測牛I 型皰疹病毒結果的比較研究

張光磊，魏田田，高 月，梁云坤

吉林省敦化市農業農村局畜牧站，吉林敦化 133700

牛I 型皰疹病毒是在α-皰疹病毒亞科中水痘類病毒的成員，屬于皰疹病毒科家族。該病毒發病伴隨多種臨床表現,包括：牛傳染性鼻氣管炎、外陰道炎、龜頭包皮炎、流產、結膜炎以及普通性的全身感染。最主要的經濟影響是在妊娠后半段牛傳染性氣管炎流產所產生的損失，并且常常沒有任何其他的臨床征兆。BHV-1 病毒可潛伏在三叉神經節的感覺神經元中，主要感染源是鼻腔滲出物和飛沫、生殖分泌物、精子以及肽液。BHV-1 病毒感染主要通過PCR 分離病毒和血清學實驗進行診斷，常用血清中和檢測法進行試驗，但該方法費時費力缺乏敏感性。在本研究中，我們論述了夾心酶聯免疫吸附試驗對檢測牛I 型皰疹病毒的結果，使之能夠簡單、快速、有效地檢測出BHV-1 病毒感染。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞培養。

1.2 病毒濃度和純度測定。

1.3 兔和豚鼠抗體血清的制備。

1.4 ELISA 檢測。

1.5 抗體最佳稀釋濃度的測定。

1.6 過氧化物結合物最佳稀釋濃度測定。

2 結果

最佳抗體稀釋濃度用滴定盤確定，兔抗血清在稀釋比例為1:1 000、1:2 000、1:4 000 時，吸光度（A490）要高于同稀釋比例豚鼠的檢測抗體血清（高于1.5）；而在兔和豚鼠抗體中更高的稀釋比例（1:8 000,1:16 000，1:64 000.1:128 000）顯示吸光度（A490）顯著下降至1.5 以下，抗體稀釋濃度比例為1:128 000 時，吸光度值甚至低于0.1。因此，在ELISA 準備實驗前用1:4 000 稀釋比例為最佳稀釋濃度。

通過對比PCR 檢測結果來測定該方法的臨界點，用共95 個檢測樣本，58 個PCR 陰性樣本作為陰性標準。臨界值算法用PCR 陰性樣本的OD 值加三倍標準差。因此，陽性反應的臨界值確定為0.143，約為0.15。陰性樣本中陽性與陰性的比值為1.3。

表1 Sandwich ELISA 法與PCR 法檢測BHV-1 病毒結果的比較

通過PCR 法和ELISA 法檢測95 個實驗樣本，在37 個PCR 陽性樣本中采取ELISA 法檢測出3個陰性樣本；在58 個PCR 陰性樣本中用ELISA法檢測出4 個陽性樣本。敏感性：（34/34+3）×100%=91.9%；特異性：(54/4+54)×100%=93.1%。

3 討論

本研究的目的在于探討夾心酶聯免疫吸附試驗法能否檢測牛BHV-1 病毒。在任何一種新型ELISA系統里，最佳實驗條件是通過不同參數的變化來確定的。兔以及豚鼠的抗血清是通過密度梯度離心純化的BHV-1 病毒收集的，如果顛倒順序就會導致非特異性結合物的產生。在一些通過采取高純度的IgG 分泌物獲得的抗血清在一些實驗中表現出無特異性，可能是因為血清中IgG 的片段里參雜了一些未被排除的IgM 片段，從而使實驗產生非特異性反應。