夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法與PCR 法對檢測牛I 型皰疹病毒結(jié)果的比較研究

張光磊，魏田田，高 月，梁云坤

吉林省敦化市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧站，吉林敦化 133700

牛I 型皰疹病毒是在α-皰疹病毒亞科中水痘類病毒的成員，屬于皰疹病毒科家族。該病毒發(fā)病伴隨多種臨床表現(xiàn),包括：牛傳染性鼻氣管炎、外陰道炎、龜頭包皮炎、流產(chǎn)、結(jié)膜炎以及普通性的全身感染。最主要的經(jīng)濟影響是在妊娠后半段牛傳染性氣管炎流產(chǎn)所產(chǎn)生的損失，并且常常沒有任何其他的臨床征兆。BHV-1 病毒可潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元中，主要感染源是鼻腔滲出物和飛沫、生殖分泌物、精子以及肽液。BHV-1 病毒感染主要通過PCR 分離病毒和血清學(xué)實驗進行診斷，常用血清中和檢測法進行試驗，但該方法費時費力缺乏敏感性。在本研究中，我們論述了夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗對檢測牛I 型皰疹病毒的結(jié)果，使之能夠簡單、快速、有效地檢測出BHV-1 病毒感染。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞培養(yǎng)。

1.2 病毒濃度和純度測定。

1.3 兔和豚鼠抗體血清的制備。

1.4 ELISA 檢測。

1.5 抗體最佳稀釋濃度的測定。

1.6 過氧化物結(jié)合物最佳稀釋濃度測定。

2 結(jié)果

最佳抗體稀釋濃度用滴定盤確定，兔抗血清在稀釋比例為1:1 000、1:2 000、1:4 000 時，吸光度（A490）要高于同稀釋比例豚鼠的檢測抗體血清（高于1.5）；而在兔和豚鼠抗體中更高的稀釋比例（1:8 000,1:16 000，1:64 000.1:128 000）顯示吸光度（A490）顯著下降至1.5 以下，抗體稀釋濃度比例為1:128 000 時，吸光度值甚至低于0.1。因此，在ELISA 準備實驗前用1:4 000 稀釋比例為最佳稀釋濃度。

通過對比PCR 檢測結(jié)果來測定該方法的臨界點，用共95 個檢測樣本，58 個PCR 陰性樣本作為陰性標準。臨界值算法用PCR 陰性樣本的OD 值加三倍標準差。因此，陽性反應(yīng)的臨界值確定為0.143，約為0.15。陰性樣本中陽性與陰性的比值為1.3。

表1 Sandwich ELISA 法與PCR 法檢測BHV-1 病毒結(jié)果的比較

通過PCR 法和ELISA 法檢測95 個實驗樣本，在37 個PCR 陽性樣本中采取ELISA 法檢測出3個陰性樣本；在58 個PCR 陰性樣本中用ELISA法檢測出4 個陽性樣本。敏感性：（34/34+3）×100%=91.9%；特異性：(54/4+54)×100%=93.1%。

3 討論

本研究的目的在于探討夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗法能否檢測牛BHV-1 病毒。在任何一種新型ELISA系統(tǒng)里，最佳實驗條件是通過不同參數(shù)的變化來確定的。兔以及豚鼠的抗血清是通過密度梯度離心純化的BHV-1 病毒收集的，如果顛倒順序就會導(dǎo)致非特異性結(jié)合物的產(chǎn)生。在一些通過采取高純度的IgG 分泌物獲得的抗血清在一些實驗中表現(xiàn)出無特異性，可能是因為血清中IgG 的片段里參雜了一些未被排除的IgM 片段，從而使實驗產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。