豬流行性腹瀉病毒感染對豬小腸上皮細胞I型干擾素產生通路的影響

丁芳藝　宋海鑫　梁榮　苗晉鋒　費榮梅　劉永杰　余祖功　張金秋

摘要： 豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是嚴重危害仔豬腸道健康的病原之一。用病毒感染復數(shù)（MOI）=1.0的PEDV感染豬小腸上皮細胞，通過間接免疫熒光試驗，證實PEDV能在豬小腸上皮細胞中增殖。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測，發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體3（TLR3）編碼基因、視黃醇誘導基因 I/黑色素瘤分化相關基因5（RIG-I/MDA5）的mRNA表達水平分別從感染后2 h、4 h開始顯著升高（P<0.05），分別在感染后12 h、24 h達到最高值;線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）編碼基因的mRNA相對表達量從感染后6 h開始顯著升高（P<0.05），隨后基本保持不變。下游接頭蛋白質β干擾素TIR結構域銜接蛋白質（TRIF）、腫瘤壞死因子相關因子3（TRAF3）、IκB 激酶ε（IKK-ε）和TANK結合激酶1（TBK1）編碼基因的mRNA相對表達量在感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），隨后IKK-ε編碼基因的mRNA相對表達量在感染后8 h達到最高值，TRIF、TRAF3和TBK1編碼基因的mRNA相對表達量均在感染后12 h達到最高值。干擾素調節(jié)因子3（IRF3）編碼基因的mRNA相對表達量在感染早期無顯著變化，在感染后24 h達到最高值（P<0.05）。與對照組相比，PEDV感染無法誘導豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）IFN-β編碼基因的mRNA相對表達量顯著升高，但能有效抑制Poly（I：C）（聚肌胞苷酸）誘導的IFN-β產生。結果表明，PEDV能夠在感染早期激活TLRs、RLRs介導的I型IFN產生通路中相關受體及接頭蛋白質的基因表達，但最終能抑制干擾素產生，并能在豬小腸上皮細胞中有效增殖。

關鍵詞： 天然免疫;豬流行性腹瀉病毒;豬小腸上皮細胞;I型干擾素

中圖分類號： S828.7 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0099-07

Effects of porcine epidemic diarrhea virus infection on IFN-β production pathway in porcine intestinal epithelial cells

DING Fang-yi 1，2，3， SONG Hai-xin 1，2，3， LIANG Rong1，2，3， MIAO Jin-feng2， FEI Rong-mei2， LIU Yong-jie2， YU Zu-gong2， ZHANG Jin-qiu 1，3，4，5

（1.Institute of Veterinary Immunology and Engineering， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;3.Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety——State Key Laboratory Cultivation Base， Nanjing 210014， China;4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009， China;5.College of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： Porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） is one of the pathogens that seriously endanger the intestinal health of piglets. Porcine intestinal epithelial cells （IPEC-J2） were infected with PEDV at a multiplicity of infection MOI of 1.0. Virus proliferation in IPEC-J2 was observed by indirect immunofluorescence assay （IFA）. Through real-time fluorescent quantitative PCR （RT-PCR） detection， it was found that the mRNA levels of TLR3 encoding gene and RIG-I/MDA5 significantly increased from 2 hours post infection （hpi） and 4 hpi， respectively （P<0.05）， and peaked at 12 hpi and 24 hpi. The relative mRNA expression of mitochondrial antiviral signaling protein （MAVS） coding gene significantly increased at 6 hpi （P<0.05）， and then remained unchanged. The mRNA levels of TRIF， TRAF3， IKK-ε and TBK1 coding genes significantly increased from 4 hpi （P<0.05）， and then the relative mRNA expression of IKK-ε encoding genes reached the highest level at 8 hpi while TRIF， TRAF3 and TBK1 encoding genes at 24 hpi. The relative mRNA expression of interferon regulatory factor 3 （IRF3） encoding gene showed no significant change at the early stage after infection， and reached the highest level at 12 hpi. Compared with control group， there was no significant difference of IFN mRNA expression in IPEC-J2 infected with PEDV. However， PEDV infection could inhibit the production of IFN-β induced by Poly（I：C）. The results suggested that PEDV could activate TLRs and RLRs signaling pathway in the early stage after infection， and effectively proliferate in IPEC-J2 by inhibiting IFN-β.

Key words： innate immunity;porcine epidemic diarrhea virus;porcine intestinal epithelial cells;type I interferon

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，是近年來導致新生仔豬急性腸炎及水樣腹瀉致死的主要病原之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大威脅[1]。尤其是2010年以來，隨著PEDV新變異株的出現(xiàn)，美洲、歐洲及亞洲的多個國家再次暴發(fā)豬流行性腹瀉，使養(yǎng)豬業(yè)遭受了嚴重的經濟損失[2]。

PEDV基因組全長約為28 kb，含有5′端帽子結構和3′端Poly（A）尾巴，從5′端開始，依次為5′端非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）、7個開放閱讀框（Open reading frame， ORF）（包括ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF6）和3′端UTR[3]。病毒感染細胞后，病毒基因組RNA及其在復制過程中產生的單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）能夠被胞質中的（RIG-I）樣受體家族（RIG-I-like receptors，RLRs）或內體中Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）識別，通過視黃醇誘導基因（RIG-I）/黑色素瘤分化相關基因5（MDA5）/線粒體抗病毒信號蛋白質（Mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS）或/和TLR3/β干擾素TIR結構域銜接蛋白質（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）等通路進行信號傳遞，促進I型IFN及相關促炎細胞因子的產生，發(fā)揮細胞的抗病毒功能，這是宿主細胞抵御病毒入侵的第一道防線[2]。

近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)，PEDV能夠通過不同方式抑制I型IFN的產生[4-5]，但是具體的分子機制尚未完全明確。本研究以PEDV經典毒株CV777作為模式株，用其感染豬小腸上皮細胞，檢測宿主細胞相關受體TLR3、RIG-I以及MDA5和重要接頭蛋白質TRIF、MAVS、腫瘤壞死因子相關因子3（TNF receptor-associated factor 3，TRAF3）、TANK結合激酶1（TBK1）、IκB 激酶ε（IKK-ε）、干擾素調節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3， IRF3）、效應分子IFN-β表達水平的變化，以期深入了解宿主細胞抵御PEDV感染及機體整體天然免疫變化的規(guī)律，為進一步理解宿主清除PEDV的免疫機制及PEDV的拮抗機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

PEDV CV777株、豬小腸上皮細胞（IPEC-J2），由筆者所在實驗室保存;PEDV-N蛋白單克隆抗體，由筆者所在實驗室制備;羊抗鼠熒光二抗，購自北京Solarbio科技有限公司;RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑，購自TaKaRa公司;轉染試劑Lipofectamine 3000 Reagent Protocol，購自Invitrogen公司;Poly（I：C）（聚肌胞苷酸）購自Sigma Aldrich公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與病毒增殖 將凍存的IPEC-J2細胞從液氮罐中取出，在37 ℃水浴中快速融化后于1 000 r/min離心10 min。棄去凍存液，加入完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清的DMEM）重懸細胞后，將重懸細胞液轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶內，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內。當細胞鋪滿至單層后，將細胞傳代，接種至6孔板中，待細胞匯合度達到90%左右時，按病毒感染復數(shù)（MOI）=1.0接種PEDV病毒，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 間接免疫熒光 將IPEC-J2細胞接種于24孔板中，分別按MOI=0.1、MOI=1.0接種PEDV，設置未接毒的陰性對照。培養(yǎng)24 h后棄去細胞培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3遍，隨后加入固定液，用PBS清洗3遍，加入0.2% TritonX-100于室溫孵育后，用PBS清洗3遍，再用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，然后用PBS清洗3遍，加入PEDV N蛋白抗體于37 ℃孵育1 h，用PBS清洗3遍，加入熒光二抗，于37 ℃避光孵育1 h，用PBS清洗3遍后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞轉染 將IPEC-J2細胞接種至6孔板中，待細胞匯合度約為90%時，用不含有血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（125 μl）稀釋Lipofectamine 3000（5 μl）試劑，充分混勻。隨后用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基（125 μl）稀釋Poly（I：C）（Sigma），再添加10 μl P3000試劑制備Poly（I：C）預混液，充分混勻后在室溫下孵育15 min。將混合后的復合物加入6孔板中，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液，于37 ℃孵育，24 h后收集樣品，提取細胞總RNA。

1.2.4 細胞總RNA的提取及cDNA的合成 用RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取細胞樣品的RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，反應體系如下： 2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time），500 ng總RNA，用RNase Free dH2O補足總體積至10 μl。將上述溶液混勻后，設置如下反應程序：37 ℃ 15 min，85℃ 5 s，4 ℃終止反應。將得到的cDNA儲存于-20 ℃，用于后續(xù)試驗。

1.2.5 實時熒光定量RT-qPCR 以方法1.2.4中合成的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）。20 μl反應體系如下： 10 μl 2×TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus），0.8 μl PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.8 μl PCR Reverse Primer（10 μmol/L），2 μl DNA模板，6.4 μl RNase Free dH2O。PCR反應條件： 95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品設3個重復，用2-△△Ct法計算結果。擴增引物序列見表1。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 用GraphPad Prism 6軟件作圖并分析數(shù)據(jù)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PEDV感染IPEC的間接免疫熒光檢測

分別按MOI=0.1、MOI=1.0對豬小腸上皮細胞接種PEDV，24 h后收集樣品，固定、封閉后加入PEDV N蛋白抗體和熒光二抗，通過熒光顯微鏡觀察病毒的增殖情況。由圖1可以看出，感染后24 h在豬小腸上皮細胞中能有效地檢測到PEDV N蛋白的表達，且N蛋白表達量與病毒感染劑量呈正相關。

2.2 TLRs及RLRs信號通路中不同受體在mRNA相對表達量上的變化

豬小腸上皮細胞按MOI=1感染PEDV后，分別于感染后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h收集細胞。提取各時間點樣品的RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR檢測，觀察TLRs、RLRs信號通路中相關受體編碼基因在病毒感染后24 h內mRNA表達水平的動態(tài)變化。由圖2可以看出，與對照組相比，TLR3編碼基因以及RIG-I、MDA5的mRNA相對表達量均在感染后出現(xiàn)顯著變化，其中TLR3編碼基因、RIG-I的mRNA相對表達量從感染后2 h開始顯著升高（P<0.05），MDA5的mRNA相對表達量從感染后4 h開始顯著升高（P<0.05），TLR3編碼基因和RIG-I、MDA5的mRNA相對表達量在感染后12 h或24 h達到最高值。

2.3 TLRs及RLRs信號通路中關鍵接頭蛋白質在mRNA相對表達量上的變化

用MOI=1.0的PEDV感染IPEC-J2，分別于感染后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h收集樣品，通過RT-qPCR方法觀察TLRs和RLRs通路中不同蛋白質在mRNA表達水平的變化。由圖3可以看出，TRIF、TRAF3編碼基因的mRNA相對表達量在感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），之后稍微下降，又于感染后24 h達到最高值。MAVS編碼基因的mRNA相對表達量在感染后6 h開始顯著上升（P<0.05），在感染后8 h、12 h、24 h之間無顯著差異。IKK-ε、TBK1編碼基因的mRNA相對表達量均于感染后4 h出現(xiàn)顯著上升（P<0.05），隨后IKK-ε編碼基因的mRNA相對表達量在感染后8 h達到最高值，而TBK1編碼基因的mRNA相對表達量在感染6 h后先稍有下降后又上升，至感染后24 h時達到最高值（P<0.05）。IRF3編碼基因的mRNA相對表達量在感染早期（感染后0～8 h）無顯著變化，在感染后12 h達到最高值（P<0.05）。

2.4 TLRs及RLRs信號通路效應分子IFN-β在mRNA表達水平上的變化

用MOI=1.0的PEDV感染IPEC-J2細胞，并向其中1組轉染1 μg Poly（I：C），同時設置不接種病毒的陰性對照和只轉染Poly（I：C）的陽性對照。結果顯示，PEDV感染后對IPEC-J2細胞中的IFN-β在mRNA表達水平上無顯著影響，但是能夠有效抑制Poly（I：C）誘導IFN-β，詳見圖4。

3 討論

PEDV的體外培養(yǎng)一直是業(yè)內的難題，Hofmann等[6]最早于1988年首次在添加了胰酶的Vero（非洲綠猴腎細胞）中成功擴增出PEDV。目前，PEDV的體外復制和增殖主要是在Vero細胞上進行的，并缺失I型IFN基因簇，進而導致I型IFN表達缺陷，因此不適合用于研究病毒對宿主細胞天然免疫的影響。另外，MARC-145（非洲綠猴胚胎腎細胞）、LLC-PK1（豬腎細胞）和ST（豬睪丸細胞）等細胞系也曾被用于PEDV的體外研究，但是這些細胞并非PEDV等腸道冠狀病毒感染的靶細胞，因此可能無法真實反映病毒拮抗宿主天然免疫反應的變化規(guī)律。近年來，豬小腸上皮細胞系IPEC-J2在研究PEDV的致病機制過程中發(fā)揮了重要作用。作為PEDV感染的主要靶細胞，IPEC-J2可能更適于研究病毒對宿主天然免疫的影響及調節(jié)作用。因此，本研究選擇IPEC-J2進行試驗。

本研究首先觀察了PEDV在IPEC-J2細胞中的增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)：用不同MOI的PEDV感染IPEC-J2細胞后，24 h內均能檢測到PEDV N蛋白的表達，且N蛋白表達量與病毒感染復數(shù)呈正相關，表明PEDV能夠有效感染IPEC-J2細胞，并能在細胞內有效增殖，這為下一步研究PEDV感染對IPEC-J2細胞中I型IFN產生通路中的相關受體、接頭蛋白質及效應蛋白質的影響奠定了基礎。

天然免疫在限制病毒的感染和早期擴散方面發(fā)揮著重要作用。宿主細胞可通過不同模式識別受體以感知病毒的入侵，主要包括TLRs、RLRs、C型凝集素受體家族（CLRs）及核苷酸寡聚化結構域樣受體家族（NLRs）等[7]。其中與RNA病毒感染密切相關的是由RLRs、TLRs介導的信號轉導途徑。RNA病毒感染細胞后，病毒基因組RNA及復制過程中產生的ssRNA、dsRNA被胞質中的RIG-I/黑色素瘤分化相關基因5識別，隨后通過MAVS傳遞信號，招募TRAF3/6，進一步激活TBK1/IKK激酶復合體并使其發(fā)生磷酸化，最終使NF-κB、IRFs等核轉錄因子磷酸化，形成同二聚體或異二聚體，然后進入細胞核，啟動 Ⅰ 型干擾素轉錄。本研究發(fā)現(xiàn)，PEDV感染IPEC-J2細胞后，RIG-I、MDA5等受體及TRAF3、TBK1等接頭蛋白質編碼基因的mRNA相對表達量分別從感染后2 h或4 h開始顯著升高（P<0.05），在感染后12 h或24 h達到最高值，表明病毒RNA或復制過程中產生的大量ssRNA或dsRNA能夠被胞漿中相應的模式識別受體RIG-I、MDA5等感知并識別，相關受體及接頭分子均被快速激活，進而啟動下游信號傳遞。另外，關鍵接頭蛋白質MAVS編碼基因的mRNA相對表達量在感染后6 h開始顯著上升（P<0.05），隨后基本保持不變，提示MAVS發(fā)揮其信號傳遞作用可能與其mRNA表達水平的關系不密切，這與筆者所在實驗室前期針對流感病毒的研究結果一致[8]。目前的研究結果表明，MAVS的活化及下游信號傳遞與N端的CARD樣結構域和C端的TM結構密切相關，兩者共同介導MAVS復合體的構象改變、泛素化降解及下游的信號傳遞。在此過程中，MAVS在蛋白質水平的降解對其介導的I型IFN的產生是必不可少的[9-10]。

進入內體中的病毒RNA能夠被胞內受體如TLR3、TLR7或TLR8識別，進而招募其下游接頭蛋白質，如MyD88、TRIF、TRAF3/6等，并將信號傳遞給NF-κB、IRFs等核轉錄因子，進而誘導Ⅰ型干擾素及促炎癥細胞因子的產生。本試驗結果表明，TLR3編碼基因的mRNA相對表達量從感染后2 h開始顯著升高（P<0.05），在感染后12 h即達到最高值;TRIF、TRAF3編碼基因的mRNA相對表達量從感染后4 h開始顯著升高（P<0.05），在感染后24 h達到最高值，表明病毒復制過程中產生的部分dsRNA能夠被內體中TLR3受體快速識別并激活下游的信號傳遞過程。由此可見，PEDV感染豬小腸上皮細胞可以激活TLR3等受體途徑，進而引起NF-κB活化，這與Cao等[11]的研究結果一致。

Poly（I：C）是dsRNA類似物，進入細胞后可以激活TLRs和RLRs信號通路，誘導細胞產生干擾素[12]。本試驗以Poly（I：C）作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)按MOI=1.0對IPEC-J2細胞接種PEDV 24 h后，細胞中的IFN-β編碼基因在mRNA表達水平無顯著變化，并且發(fā)現(xiàn)PEDV能夠有效抑制Poly（I：C）誘導的IFN-β產生，這與孫敏[13]的研究結果一致。但李亮[14]研究發(fā)現(xiàn)，用MOI=5.0的PEDV-JMS毒株感染回腸類器官細胞后，IFN-α編碼基因的mRNA表達水平在感染24 h內升高了2倍，推測可能與毒株特性、細胞模型及病毒的感染劑量有關，具體有待于進一步驗證。

綜上所述，PEDV能夠激活TLRs/RLRs及下游關鍵接頭蛋白質的表達，但是最終能夠抑制Ⅰ型IFN的產生，從而在豬小腸上皮細胞中有效增殖，推測PEDV對該天然免疫信號通路仍存在負調控機制。如Cao等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，PEDV可以抑制RIG-I、MAVS介導的IFN-β啟動子活性，但不能下調TBK1/IKK-ε介導的IFN-β啟動子活性，因此推測PEDV阻斷IFN-β信號傳遞的作用位點在TBK1/IKK-ε上游。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，PEDV編碼的N蛋白、木瓜樣蛋白酶（PLP），Nsp1、Nsp5編碼的3CLpro及Nsp7可能參與調控宿主細胞的I型IFN應答[16-20]。由此可見，關于PEDV編碼蛋白質參與調控宿主I型IFN應答的分子機制仍需進一步探索，這也是今后研究的重點。

參考文獻：

[1] CAVANAGH D. Nidovirales： a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J]. Archives of Virology， 1997， 142（3）： 629-633.

[2] SUN R Q， CAI R J， CHEN Y Q， et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets， China[J]. Emerging Infectious Diseases， 2012， 18（1）： 161-163.

[3] KOCHERHANS R， BRIDGEN A， ACKERMANN M， et al. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus （PEDV） genome sequence[J]. Virus Genes， 2001， 23（2）： 137-144.

[4] XING Y L， CHEN J F， TU J， et al. The papain-like protease of porcine epidemic diarrhea virus negatively regulates type I interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase[J]. The Journal of General Virology， 2013， 94（7）： 1554-1567.

[5] DING Z， FANG L R， JING H Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid protein antagonizes beta interferon production by sequestering the interaction between IRF3 and TBK1[J]. Journal of Virology， 2014， 88（16）： 8936-8945.

[6] HOFMANN M， WYLER R. Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture[J]. Journal of Clinical Microbiology， 1988， 26（11）：2235-2239.

[7] THOMPSON M R， KAMINSKI J J， KURT-JONES E A， et al. Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection[J]. Viruses， 2011， 3（6）： 920-940.

[8] ZHANG J Q， MIAO J F， HOU J B， et al. The effects of H3N2 swine influenza virus infection on TLRs and RLRs signaling pathways in porcine alveolar macrophages[J]. Virol Journal， 2015， 12： 61.

[9] KAWAI T， TAKAHASHI K， SATO S， et al. IPS-1， an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction[J]. Nature Immunology， 2005， 6（10）： 981-988.

[10]XU L G， WANG Y Y， HAN K J， et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-β signaling[J]. Molecular Cell， 2005， 19（6）： 727-740.

[11]CAO L Y， GE X Y， GAO Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus infection induces NF-κB activation through the TLR2， TLR3 and TLR9 pathways in porcine intestinal epithelial cells[J]. Journal of General Virology， 2015， 96（7）： 1757-1767.

[12]MIAN M F， AHMED A N， RAD M， et al. Length of dsRNA （poly I：C） drives distinct innate immune responses， depending on the cell type[J]. Journal of Leukocyte Biology， 2013， 94（5）： 1025-1036.

[13]孫 敏. 豬流行性腹瀉病毒遺傳變異規(guī)律與Ⅰ型干擾素逃避機制[D]. 南京：南京農業(yè)大學， 2017.

[14]李 亮. 豬腸類器官模型的建立及干擾素λ在腸道黏膜免疫中抗豬流行性腹瀉病毒（PEDV）作用機制的研究[D]. 北京： 中國農業(yè)大學， 2019.

[15]CAO L Y， GE X Y， GAO Y， et al. Porcine epidemic diarrhea virus inhibits dsRNA-induced interferon-β production in porcine intestinal epithelial cells by blockade of the RIG-I-mediated pathway[J]. Virology Journal， 2015， 12： 127.

[16]DING Z， FANG L， JING H， et al. Porcine epidemic diarrhea virus nucleocapsid protein antagonizes beta interferon production by sequestering the interaction between IRF3 and TBK1[J]. Journal of Virology， 2014， 88（16）： 8936-8945.

[17]XING Y L， CHEN J F， TU J， et al. The papain-like protease of porcine epidemic diarrhea virus negatively regulates type Ⅰ interferon pathway by acting as a viral deubiquitinase[J]. Journal of General Virology， 2013， 94（7）： 1554-1567.

[18]ZHANG Q Z， SHI K C， YOO D W. Suppression of type Ⅰ interferon production by porcine epidemic diarrhea virus and degradation of CREB-binding protein by nsp1[J]. Virology， 2016， 489： 252-268.

[19]ZHU X Y， FANG L R， WANG D， et al. Porcine deltacoronavirus nsp5 inhibits interferon-β production through the cleavage of NEMO[J]. Virology， 2017， 502： 33-38.

[20]李紅杰，王曉雪，高冬生，等. 豬流行性腹瀉病毒Nsp7的亞細胞定位和對Ⅰ型干擾素應答的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報， 2017， 48（3）： 501-507.

（責任編輯：徐 艷）

收稿日期：2020-09-15

基金項目：國家自然科學基金項目（31772701）;江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（17）3027]

作者簡介：丁芳藝（1995-），男，江西上饒人，碩士，主要從事畜禽疫病防控方向的研究。（E-mail）dingfy0526@163.com。宋海鑫為共同第一作者。

通訊作者：張金秋，（E-mail）jqzh03@126.com