基于候選基因開發gSSR標記加密黃花菜和萱草種間遺傳圖譜

高陽　侯非凡　熊雄　公菲菲　王金耀　邢國明　李森

摘要： 為了更加精準地開展黃花菜基因組組裝和性狀定位，在課題組前期構建的大同黃花×搖籃曲種間遺傳圖譜的基礎上，基于大同黃花全基因組和轉錄組數據庫，針對秋水仙堿及晝夜節律2個關鍵性狀所涉及的候選Unigene開發基因組SSR標記，進一步通過55個F1后代加密圖譜。結果表明，新開發的95個gSSR標記中有46個標記在親本及子代間具有多態性，多態性比例為48.42%，有22個gSSR標記到圖譜上，同時有12個前期未上圖的EST-SSR標記加密到新圖譜。加密后的遺傳圖譜包含255個標記，由9個連鎖群組成，總圖距為3 142.64 cM，平均圖距為11.88 cM，各連鎖群標記數量為5～58個。研究結果為進一步研究黃花菜秋水仙堿含量及晝夜節律的功能基因定位奠定了重要基礎。

關鍵詞： 黃花菜;gSSR;標記開發;圖譜加密

中圖分類號： Q755 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0139-11

Enhancement of the interspecific genetic map density for Hemerocallis citrina and H. fulva by developing gSSR markers based on candidate genes

GAO Yang1，2， HOU Fei-fan1，2，3， XIONG Xiong1，2， GONG Fei-fei1，2， WANG Jin-yao1，2，3， XING Guo-ming1，2，3， LI Sen1，2，3

（1.College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China;2.Datong Huanghua Industry Development Research Institute，Datong 037004，China;3.Collaborative Innovation Center of Quality and Profit Improvement for the Facility Vegetables of Shanxi Province，Taigu 030801，China）

Abstract： To carry out genome assembly and character mapping of Hemerocallis citrina more accurately， genomic simple sequence repeats （SSR） markers were developed for the candidate Unigenes involved in two key characters （colchicine and circadian rhythm）， on the basis of the interspecific genetic map of DatongHuanghua×Lullaby Baby constructed by our research group previously and the whole genome and transcriptome database of DatongHuanghua. The map density was further enhanced through 55 F1 progenies. The results showed that 46 of the 95 newly developed gSSR markers were polymorphic between parents and offsprings， with a polymorphic ratio of 48.42%. 22 gSSR markers were added to the map， while 12 EST-SSR markers not mapped earlier were added to the new map. The updated genetic map contained 255 markers which was composed of nine linkage groups. The total map distance was 3 142.64 cM， and the average map distance was 11.88 cM. The number of markers in each linkage group ranged from 5 to 58. The results can make important foundation for further study on colchicine content and functional gene mapping of circadian rhythm in H.citrina.

Key words： Hemerocallis citrina;gSSR;marker development;density enhancement of the genetic linkage map

萱草屬（Hemerocallis spp.）植物是世界著名的宿根花卉之一，Li等[1]將155個萱草屬植物品種分為黃花菜（Hemerocallis citrina）等夜間開花類群和萱草（Hemerocallis fulva）等白天開花類群。黃花菜花蕾營養價值豐富，又名“金針菜”，是一種重要的藥食兼用型功能蔬菜[2-4]，產量、品質和營養成分含量是其重要的育種目標，黃花菜中富含多種次生代謝物，這些物質在現代醫學及生物學研究中發揮著重要作用[5]。黃花菜新鮮花蕾中含有次生代謝物秋水仙堿[6-7]，有報道顯示鮮食黃花菜可能產生中毒現象，導致腹瀉等不良反應[8]。萱草花色、花型豐富，耐干旱瘠薄，是重要的園林綠化材料，其育種主要圍繞改良觀賞性狀、提升觀賞價值來進行[9]，萱草的觀賞性主要體現在花器官，而萱草屬植物花器官存在明顯的晝夜節律現象，該現象成為影響其觀賞性的重要因素。綜上，在黃花菜與萱草育種過程中，次生代謝物含量和花器官晝夜節律現象是2個值得重點關注和研究的性狀。由于萱草屬植物為宿根植物，新品種多通過自然發現新優性狀種質后無性擴繁獲得，育種存在盲目性和隨機性。分子標記輔助選擇育種是開展多年生植物新品種選育的有效手段，性狀選擇有針對性，育種年限可大幅縮短。其中，高密度遺傳圖譜是開展重要農藝性狀分子標記輔助育種的重要基礎。

萱草屬植物遺傳背景較為復雜[10]，童期較長，制作高代自交系難度較大，截至目前僅發表了2張本屬植物的遺傳圖譜。侯非凡[11]于2017年基于大同黃花（Hemerocallis citrina cv. DatongHuanghua）轉錄組數據，利用“擬測交”策略構建了1張包含199個EST-SSR（表達序列標簽微衛星）分子標記、11個連鎖群的黃花菜種內遺傳圖譜，總圖距為2 522.34 cM，標記間平均圖距為12.68 cM;同時構建了1張黃花菜與萱草種間遺傳圖譜，包含222個EST-SSR分子標記、11個連鎖群，總圖距為2 485.59 cM，標記間平均圖距為11.20 cM。2張圖譜標記數量有限，標記開發缺乏一定的針對性。

本研究基于課題組前期已獲得的大同黃花全基因組數據及轉錄組數據，使用秋水仙堿及晝夜節律所涉及的代謝通路上的候選Unigene與基因組數據進行比對，開發與這2個性狀相關的基因組gSSR（基因組SSR）標記，對侯非凡[11]構建的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜進行加密，旨在獲得1張密度更高的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜，為黃花菜和萱草的關鍵性狀基因定位和QTL（數量性狀座位）分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 gSSR標記開發

1.1.1 基于轉錄組數據的候選Unigene篩選 結合課題組已有的轉錄組數據庫[1]（NCBI項目編號為PRJNA628147;登錄號為SRR11610941、SRR11610942和SRR11610943），根據測序數據所得Unigene在KEGG數據庫中的功能注釋結果，篩選功能注釋于秋水仙堿（編號：ko00950）和晝夜節律（編號：ko04712）2條代謝通路中的Unigene作為候選基因。

1.1.2 基于基因組的候選Scaffold序列獲取 結合課題組大同黃花全基因組De Novo測序結果（基因組序列未發布），使用Blastn 2.2.31軟件將候選Unigene與基因組序列進行比對，設軟件中E-value等參數為默認值，篩選其中最佳的Scaffold序列。根據篩選結果，使用faSomeRecords腳本（http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/）提取基因組中目標Scaffold序列，統計各候選Unigene比對到基因組Scaffold上的區間位置信息，將每個比對位點上游、下游各擴展3 kb序列，使用BioEdit軟件將此區間序列導出。

1.1.3 SSR識別及引物設計 本研究采用SSRHunter1.3軟件識別候選Scaffold序列中的SSR位點[12]。設置構成重復元件的核苷酸數最多為6個，重復次數最少為5次，進行SSR位點識別。SSR基序分析參考Zhang等[13]的方法。使用Primer Premier 5進行引物設計，主要參數：引物長度為20～26 bp，退火溫度（Tm）為58～62 ℃，（G+C）含量為45%～55%，PCR擴增產物大小為150～300 bp，引物均由南京鐘鼎生物技術有限公司合成。

1.2 萱草屬植物種間遺傳圖譜的加密

1.2.1 作圖親本及作圖群體 作圖群體引自課題組前期以黃花菜地方品種大同黃花作為雜交母本，萱草園藝品種搖籃曲（Hemerocallis fulva Lullaby Baby）作為雜交父本（圖1）構建的55株F1代群體[11]，親本材料在開花時間、花色與花型上具有較大差別，且在所有的種間雜交組合中，大同黃花×搖籃曲組合的坐果率與萌發率較高，收獲了最多的F1雜交子代，因此使用大同黃花、搖籃曲作為構建黃花菜和萱草種間遺傳圖譜的親本，親本及雜交F1代群體現保存于山西農業大學萱草種質資源圃內。

1.2.2 DNA提取 采取改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[11]提取親本及55個F1子代DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度，使用NanoDrop Spectrometer檢測DNA濃度與純度，合格樣品于-20 ℃冰箱存放備用。

1.2.3 SSR引物篩選及擴增 本試驗中所有gSSR引物均來自1.1.3中Primer Premier 5的設計結果，標記名稱延續冀芳芳[14]的命名方式，以sau開頭，順次編號為sau01169、sau01170等。利用母本大同黃花和父本搖籃曲及從F1代中隨機選取的4個子代共6個樣品來篩選多態性SSR引物。PCR擴增、PCR擴增產物凝膠電泳檢測、SSR標記分離檢測、讀帶數據處理等參照侯非凡[11]的方法。

1.2.4 圖譜加密 利用Joinmap 4.1軟件對新開發的gSSR標記及原始圖譜構建時所使用的標記進行分析和作圖，從而加密原始種間遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 候選Unigene的篩選

秋水仙堿屬于異喹啉類生物堿，共有20個Unigene注釋到秋水仙堿生物合成所在的異喹啉類生物堿代謝通路中，其在KEGG數據庫中的通路編號為ko00950。結合轉錄組數據中基因功能注釋結果，20個Unigene所注釋到的酶均為秋水仙堿合成通路中所涉及的關鍵酶（表1）。

基于植物晝夜節律代謝通路圖（KEGG數據庫編號為ko04712），其中心振蕩環上共有6個基因，分別為CCA1、LHY、TOC1、APRR1、ZTL、GI。結合轉錄組數據中基因功能注釋結果，共18個Unigene注釋為這6個基因。由于本試驗基于擬南芥LHY基因的CDS（編碼序列）對Unigene庫進行BLAST分析，未直接注釋到LHY基因的c56440.graph_c0與擬南芥中的LHY基因序列相似度較高，所以將此Unigene也加入到候選Unigene范圍（表1）。

綜上，共有39個Unigene成為本試驗候選Unigene。

2.2 候選Scaffold序列比對結果

39條候選Unigene的BLAST報告篩選結果表明，與秋水仙堿合成通路相關的20條Unigene中共有9條比對到了基因組序列上，涉及16條Scaffold序列;與植物晝夜節律代謝通路的中心振蕩環相關的19條Unigene中共有11條Unigene比對到了基因組序列上，涉及35條Scaffold序列（表2）。綜上，共得到51條候選Scaffold序列。其中與晝夜節律相關的c58223.graph_c0比對到的Scaffold序列最多，為8條。c56932.graph_c0和mergeScaf2663序列相似性最高，比對分數為3 781分，c56403.graph_c0的比對分數最低。

根據各候選Unigene比對到基因組Scaffold上的區間位置信息，將每個位點上下游各擴展3 kb序列，即區間共擴展6 kb序列，候選序列在各Scaffold自5′端到3′端的位置信息如表2所示。

2.3 候選Scaffold序列中SSR基序的鑒定

SSRHunter 1.3檢測結果表明，有36條Scaffold檢測到了SSR位點，其中與秋水仙堿相關的Scaffold為11條，與晝夜節律相關的Scaffold為25條。在上述36條Scaffold序列中共有95個gSSR位點，其中mergeScaf17449包含最多的gSSR（12個），其次是mergeScaf1943（8個），有9條Scaffold只能檢測到1個gSSR位點（圖2）。

此外，在檢測到的95個gSSR位點中，基序類型為二核苷酸重復（Di）的有67個，占gSSR位點總數的70.53%;基序類型為三核苷酸重復（Tri）的共有25個，占比26.32%（圖3A）;基序類型為四核苷酸重復（Tetra）、五核苷酸重復（Penta）、六核苷酸重復（Hexa）的gSSR位點數很少。在36條Scaffold中統計了每種SSR基序重復元件數量的分布，在二核苷酸重復類型中，含有AT & TA、AG & GA單元的二核苷酸SSR數量要明顯多于其他類型的二核苷酸重復;在其余核苷酸重復類型中，并未出現以TG、CG或GC作為重復單元的基序（圖3B）。

2.4 gSSR引物篩選及多態性分析

對檢測到的95個gSSR位點設計相應的引物并進行多態性篩選，部分結果如圖4所示。結果表明，共有69對gSSR引物能夠擴增出清晰穩定的條帶，占引物總數的72.63%;共有46對gSSR引物在親本及子代間具有多態性，多態性gSSR引物占引物總數的48.42%。

使用多態性引物在群體中進行擴增，共有29對gSSR引物擴增產物條帶可以判讀，經過卡方（χ2）測驗檢測這29對多態性SSR引物擴增產物在子代中的分離情況，其中22對引物所得產物在子代中分離情況符合孟德爾分離比例（1∶1，1∶2∶1，1∶1∶1∶1），7對引物所得產物存在不同程度偏分離現象（P<0.05），偏分離標記占多態性引物的比例為24.13%。29對引物具體分離情況見表3。

2.5 種間遺傳圖譜加密

利用Joinmap 4.1軟件加密黃花菜種間遺傳圖譜，共有291個SSR標記參與運算，其中包括課題組前期開發的262個EST-SSR標記以及29個新開發的gSSR標記。在LOD值為3.0時劃分為9個連鎖群。制圖過程中有13個標記（12個EST-SSR標記和1個gSSR標記）由于對連鎖群結構和標記分布均勻性產生較大影響而舍去，有23個標記（17個EST-SSR標記和6個gSSR標記）由于形成單標記或者雙標記連鎖群而未能進入最終的圖譜。連鎖圖譜總圖距為3 142.64 cM，圖譜長度較原始種間圖譜增加了657.05 cM，連鎖群（LG）長度為28.26～879.50 cM（表4）。

圖譜共有255個標記，包括233個EST-SSR標記以及22個gSSR標記。相鄰標記中最大間距大于80 cM的間距共有4個，分別位于LG1、LG2、LG3和LG8，最大的間距為150.28 cM，這個間距位于LG2的sau555、sau481和sau825之間（圖5）。圖譜平均圖距為11.88 cM。加密后的黃花菜與萱草種間遺傳圖譜中SSR標記在9個連鎖群上的分布是不均勻的，各連鎖群標記數量為5～58個，標記數量最多的連鎖群為LG1，共有58個標記;LG9的標記數量最少，為5個（表4）。共有22個gSSR標記被加密到種間遺傳圖譜上，其中7個gSSR標記來源于秋水仙堿代謝通路相關候選Scaffold，15個標記來源于晝夜節律代謝通路候選Scaffold，這些標記位于LG1、LG2、LG3、LG4和LG7上（圖5）。其中，位于LG1的sau01228和sau01182在遺傳圖譜上位于同一遺傳距離，2個標記是由不同性狀的候選基因開發而來的，其對應的Scaffold序列是不同的，2個標記在群體中的基因分型也是不同的，sau01228為nn×np分型，sau01182為ef×eg分型，是不一樣的2個標記。類似的情況也出現在LG3上的sau01263、sau01260和sau01254這3個標記，它們位于不同的Scaffold，其在群體中的基因分型也是不同的，sau01263為nn×np分型，sau01260為ef×eg分型，sau01254為nn×np分型。

2.6 加密后圖譜的優化整合

將加密后的圖譜與課題組前期構建的框架種間遺傳圖譜[11]進行比較，結果表明，加密前黃花菜與萱草種間遺傳圖譜具有11個連鎖群（HFLG1～HFLG11），新標記具有明顯的連鎖群整合效果，加密后為9個連鎖群（LG1～LG9），其中，LG1上由于標記sau01229與sau01183的加入使得之前的HFLG2與HFLG10這2個連鎖群整合到了一起，HFLG10整體插入到了HFLG2的sau722與sau920之間，sau01179、sau01228、sau01182、sau01203和sau01214這5個標記也均勻地插入到了LG1上，并且由于這些標記的加入使得之前沒有上圖的單標記sau275與3標記sau677、sau215、sau979也加入到了LG1頂端，遺傳距離由HFLG2的401.8 cM和HFLG10的44.4 cM合并增加到了879.5 cM（圖6）。LG2中共增加了6個標記，分別為sau01174、sau01221、sau01173、sau01172、sau01201、sau01202，這些標記都加入到了LG2的偏底端位置，原HFLG1上的sau272因加密后致使LG2長度發生較大變化而舍棄。LG3上新加入了sau01263、sau01260、sau01254、sau01218、sau01226、sau01225這6個標記，連鎖群長度增加了59.8 cM，另外由于新標記的加入使得LG3上部sau779～sau1017片段發生了倒位，原本處于HFLG3底端的sau937移動到了LG3頂端。LG4由于單標記sau01233的加入使之前HFLG5和HFLG8合并為1個連鎖群，長度由HFLG5的141.1 cM和HFLG8的95.4 cM增加為253.8 cM。對LG5對應的HFLG4上的原標記進行優化調整后，之前未上圖的sau311、sau310、sau48、sau863、sau987、sau433、sau562、sau338這8個標記也加入到了LG5上。LG7加入了2個新標記sau01186以及sau01196。其余連鎖群均與之前保持一致，并未發生改變（圖6）。

3 討論

簡單重復序列（SSR）由于重復性高、特異性強等特點已經成為基因定位和遺傳多樣性研究的首選標記[15]，SSR標記廣泛應用于品種鑒定[1]、圖位克隆[16]、系統發育關系研究[13]、遺傳多樣性研究[17]、遺傳圖譜構建[18]等。目前，SSR標記的類型可以大致分為2種，一種是通過RNA-seq開發的EST-SSR標記，EST是基因表達序列，通過這種方式開發的標記主要對編碼區進行擴增，所以在物種間具有很好的通用性，并且使用這些標記構建遺傳圖譜相當于定位功能已知的基因[19]。結合關聯分析，如果某性狀與圖譜上的EST-SSR關聯，那么這個標記有極大的可能與控制該性狀的基因有關[20]。另外一種是通過基因組開發的gSSR標記，該標記是較為理想的構建圖譜的標記，大多數存在于基因組的非編碼區[21]。

基于此思路，本研究從秋水仙堿和晝夜節律相關代謝通路（ko00950、ko04712）上的候選Unigene入手，以期在候選EST-SSR附近開發gSSR標記來加密該區段。值得一提的是，在篩選晝夜節律相關Unigene時，c56440.graph_c0表現出與擬南芥中LHY基因極高的序列相似性，基于序列決定生物學功能的考慮，認為該Unigene極可能在本物種中存在LHY相關基因功能，故亦納入候選Unigene篩選范疇。

有學者的研究結果表明，使用單一類型標記構圖會導致標記分布不均勻，標記類型的不同會影響標記在連鎖群上的分布[21-22]。因此，本研究綜合使用新開發的gSSR和前期的EST-SSR 2種標記來進行圖譜構建。從結果來看，標記仍然是分布不均勻的，可能原因與標記數量不足以及標記自身的非隨機分布有關，此次圖譜加密過程僅使用了部分基因組序列來開發gSSR標記，在之后的研究中，基于全基因組SSR標記開發進行圖譜加密應該是一個有效的解決方案。此外，由于EST-SSR來自比較保守的編碼區，很多研究結果表明gSSR的多態性要高于EST-SSR[15，23]，本研究中新開發的gSSR標記多態性比例為48.42%，高于侯非凡[11]使用的EST-SSR標記（22.49%）。

理論上，分子連鎖群的數目應該與染色體數目相等[24]，加密后其連鎖群數目由11個整合為9個，這可能是由于萱草屬植物具有較為龐大的基因組（3.61 Gb），而圖5中標記只有255個，難以覆蓋整個基因組，在此基礎上開發新標記、擴大作圖群體，是填補圖譜Gap的有效方法，這也是本研究接下來的努力方向，以期為黃花菜和萱草分子標記輔助育種、關鍵性狀基因定位及數量性狀座位（QTL）分析奠定理論基礎。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-06-26

基金項目：山西農業大學青年拔尖創新人才支持計劃項目（BJRC20-1601）;山西省農業重點研發計劃重點項目（20170-3D211001-04-05、201903D211011-01）;山西省高等學校科技創新項目（2019L0375）

作者簡介：高 陽（1995-），男，山西朔州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術與遺傳改良方面的研究。（E-mail）sau_gaoyang@163.com

通訊作者：李 森，（E-mail）saulisen@163.com