密花香薷總皂苷提取工藝優化及其生物活性

石子林　李軍喬　王雅瓊　金占林

摘要： 使用響應面法優化密花香薷總皂苷提取工藝并探究其抗氧化活性及抑菌活性。以密花香薷總皂苷提取率為評估指標，以液料比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度為因素，在單因素試驗基礎上，結合響應面法優化密花香薷總皂苷提取工藝;采用2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法測定密花香薷總皂苷的抗氧化活性;并使用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌進行抑菌試驗測定其抑菌活性。結果表明，最佳提取工藝條件為：液料比20∶1 （體積質量比），乙醇體積分數62%，提取時間125 min，提取溫度69 ℃，在此提取工藝下，提取率為1.19%。密花香薷總皂苷對ABTS自由基、DPPH自由基的半抑制質量濃度（IC50）分別為0.74 mg/ml、0.56 mg/ml。密花香薷總皂苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌均有抑制作用，在質量濃度為1.0 mg/ml時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用強于對酵母菌的抑制作用。說明，采用響應面法得到的密花香薷總皂苷的最佳提取工藝簡便可行，且提取的總皂苷具有較好的抗氧化活性及抑菌活性。

關鍵詞： 密花香薷;皂苷;響應面法;提取工藝;抗氧化活性;抑菌活性

中圖分類號： R284.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0185-07

Optimization on the extraction process of total saponins from the Elsholtzia densa Benth. and its biological activity

SHI Zi-lin1，2，3， LI Jun-qiao1，2，3， WANG Ya-qiong1，2，3， JIN Zhan-lin1，2，3

（1.Tibetan Plateau Juema Research Centre， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China;2.Qinghai Provincial Key Laboratory of Highvalue Utilization of Characteristic Economic Plants， Xining 810000， China;3.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China）

Abstract： Response surface methodology was used to optimize the extraction process of total saponins from Elsholtzia densa Benth. and explore its antioxidant and antibacterial activities. Taking liquid-solid ratio， ethanol concentration， extraction time and extraction temperature as factors， extraction rate of total saponins from Elsholtzia densa Benth. as evaluation index， the extraction process was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test. The antioxidant activity of total saponins was determined by 2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radicals scavenging methods. In addition， the antibacterial activity was tested by Staphylococcus aureus， Escherichia coli and yeast. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： liquid-solid ratio 20 ml/g， ethanol concentration 62%， extraction time 125 min， extraction temperature 69 ℃. Under the above conditions， the yield was 1.19%. The half-inhibiting concentrations of ABTS and DPPH for the total saponins were 0.74 mg/ml and 0.56 mg/ml， respectively. The total saponins from Elsholtzia densa Benth. had inhibitory effects on， and yeast. Moreover， the inhibitory effect on? Staphylococcus aureus and Escherichia coli was stronger at the concentration of 1.0 mg/ml. In conclusion， the optimum extraction process of total saponins from Elsholtzia densa Benth. by response surface methodology is convenient and feasible， and the total saponins have good antioxidant and antibacterial activitive.

Key words： Elsholtzia densa Benth.;saponins;response surface methodology;extraction process;antioxidant activity;antibacterial activity

密花香薷 （Elsholtzia densa Benth.）為唇形科 （Labiatae）香薷屬 （Elsholtzia） 植物[1]，一年生草本，廣泛分布于青海、四川、甘肅、西藏等海拔2 800～4 100 m的高山、林緣、草甸等環境中[2]。密花香薷是中國的一種重要的野生草本蜜源植物、芳香植物，具有較高的藥用價值[3]，可全草入藥，具有治療夏季感冒、發熱無汗等功效[4]。

密花香薷在田間分布廣泛且常被當做惡性雜草，綜合開發利用密花香薷，既可使其變廢為寶，又大大減少除草劑使用，保護環境。包錦淵等[5]研究發現，密花香薷體內含有皂苷、黃酮、多糖、有機酸、蒽醌等活性成分。密花香薷具有較為發達的蜜腺[6]，目前對于其揮發性成分的研究較為充分，Zhou等[7]用水蒸氣蒸餾法提取密花香薷中的揮發油成分并進行GC-MS分析，結果表明密花香薷揮發油中主要成分有4-吡啶醇以及麝香草酚，且密花香薷揮發油具有潛在的殺螨活性。石子林等[8]用水提醇沉法對密花香薷多糖進行提取，優化工藝后最佳工藝下密花香薷多糖提取率為1.88%。目前尚未發現對密花香薷總皂苷的研究。

植物皂苷由糖和皂苷元組成，是一種天然的活性物質，其具有抗菌[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤、抗疲勞[11]以及降血糖[12]等多種作用。王曉娟等[13]對土家族藥物扣子七中的三萜皂苷進行研究，得出其抗腫瘤活性與齊墩果烷型皂苷密切相關。本試驗采用單因素試驗結合響應面法對密花香薷總皂苷進行提取工藝優化，并對所提取的總皂苷進行抗氧化以及抗菌活性研究，為今后密花香薷總皂苷的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

密花香薷于2019年6月采自青海省西寧市湟源縣牧場村蕨麻種植基地，經青海民族大學生態環境與資源學院李軍喬教授鑒定為唇形科香薷屬植物密花香薷。齊墩果酸標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及酵母菌均購自上海魯威科技有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

儀表恒溫水浴鍋（龍口市電爐制造廠產品）、EPED-20TH實驗室級超純水器（南京易普易達科技發展有限公司產品）、UV-5500型紫外-可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司產品）

1.3 材料預處理

將采摘的密花香薷全草自然風干至恒質量，粉碎，過60目篩，采用液料比10∶1（體積質量比）的石油醚回流脫脂，抽濾后取濾渣，風干，備用。

1.4 試驗方法

稱取1 g密花香薷粉末，以一定濃度的乙醇做溶劑，按一定比例的液料比，在一定溫度下提取一定時間后，抽濾，取濾液，旋干濾液后，用10.0 ml的乙醇定容，取0.2 ml定容后的濾液，在80 ℃水浴下揮發掉溶劑，加0.2 ml 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加0.8 ml高氯酸溶液，70 ℃水浴10 min后加冰醋酸定容至10.0 ml，之后于550 nm波長下測其吸光度。

1.5 標準曲線的制備

取5 mg齊墩果酸標準品溶于50.0 ml乙醇中得0.1 mg/ml 的齊墩果酸標準品溶液。分別吸取0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml標準品溶液于試管中，80 ℃水浴揮發掉試管內溶劑，按方法1.4中的方法顯色后測其吸光度（A）。以純水為空白對照，以吸光度（A）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標，回歸方程為：Y=34.200 0x+0.060 8 （R2=0.999 5），在0.002 mg/ml至0.010 mg/ml范圍內線性關系良好。

1.6 密花香薷總皂苷得率的測定

密花香薷總皂苷得率=（密花香薷總皂苷質量/密花香薷粉末質量）×100%

1.7 密花香薷總皂苷提取單因素試驗

按方法1.4的試驗方法，研究液料比、乙醇體積分數、提取時間以及提取溫度4個因素對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.1 液料比 稱取2 g密花香薷粉末，固定乙醇濃度70%，提取時間90 min，溫度70 ℃，考察不同液料比（體積質量比）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.2 乙醇體積分數 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質量比），提取時間90 min，提取溫度70 ℃，考察不同乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.3 提取時間 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質量比），乙醇體積分數60%，提取溫度70 ℃，考察不同提取時間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.7.4 提取溫度 稱取2 g密花香薷粉末，固定液料比20∶1（體積質量比），乙醇體積分數60%，提取時間120 min，考察不同提取溫度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）對密花香薷總皂苷提取率的影響。

1.8 密花香薷總皂苷提取工藝的響應面優化

在上述單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為自變量，以密花香薷總皂苷提取率（Y）為響應值，應用Box-Behnken響應面法試驗設計原理，采取3因素3水平試驗來選取最佳提取工藝。試驗因素水平見表1。

1.9 密花香薷總皂苷抗氧化性試驗

1.9.1 ABTS自由基清除試驗 將最佳條件下提取的密花香薷總皂苷配制成質量濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml的總皂苷溶液。將2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液與7.00 mmol/L ABTS溶液等體積混合后避光靜置過夜，再用純水將其稀釋成λ734 =0.70±0.02，得到ABTS·+工作液。精密吸取各質量濃度的密花香薷總皂苷溶液0.1 ml于試管中，滴加3.9 ml工作液，搖勻，避光靜置反應30 min后于734 nm波長處測其吸光度，得樣品組的清除率（A1）。空白組A0用0.1 ml超純水代替總皂苷溶液，對照組A2則用3.9 ml無水乙醇代替ABTS·+工作液。以VC為陽性對照，平行試驗3次，取平均值。清除率公式如下：

清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

1.9.2 DPPH自由基清除試驗 將最佳條件下提取的密花香薷總皂苷配制成質量濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml的總皂苷溶液。配制40 μg/ml的DPPH溶液，分別精密吸取各質量濃度的密花香薷總皂苷溶液0.1 ml于1.0 ml試管中，滴加0.1 ml DPPH溶液，作為樣品組A1，空白組A0用0.1 ml超純水代替總皂苷溶液，對照組A2則用0.1 ml無水乙醇代替DPPH溶液。以VC為陽性對照，平行試驗3次，取平均值。

1.10 密花香薷總皂苷抑菌活性試驗

1.10.1 培養基的制備 LB液體培養基：蛋白胨6 g/L、氯化鈉6 g/L、牛肉膏3 g/L，再用2 mol/L的氫氧化鈉調節pH為7.1，用超純水定容至500 ml，在125 ℃下滅菌30 min。向LB液體培養基中加入2%的瓊脂制成LB固體培養基。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養基：稱100 g去皮后的土豆，切碎后加水500 ml，放入鍋中煮沸25 min，用紗布趁熱將其過濾，棄除濾渣，將濾液補水至500 ml，加10 g葡萄糖，在115 ℃下滅菌30 min。

1.10.2 抑菌活性試驗 以金黃色葡萄球菌、酵母菌、大腸桿菌3種菌為指示菌，將活化后的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌種接入到LB液體培養基中，于35 ℃的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，將活化后的酵母菌菌種接種到PDB培養基中，于30 ℃的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，用移液槍分別吸取0.2 ml細菌含量為1.0×107CFU/ml的2種細菌菌懸液于LB固體培養基中，吸取0.2 ml細菌含量為1.0×107CFU/ml的酵母菌菌懸液于PDB培養基中，涂抹均勻后打孔，吸取0.1 ml質量濃度為1.0 mg/ml的密花香薷總皂苷提取液于孔中，放置恒溫培養箱中培養24 h后，測定其抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 密花香薷總皂苷提取工藝單因素試驗

2.1.1 液料比 如圖1A所示，密花香薷總皂苷提取率隨著液料比的增大呈現先增大再減小的趨勢，這可能是因為液料比過高，旋蒸時間過長，導致總皂苷有所損失。當液料比為20∶1（體積質量比）時，提取率達到最大值，此時的提取率為0.87%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳液料比為20∶1（體積質量比）。

2.1.2 乙醇體積分數 如圖1B所示，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇體積分數的增大呈現先增大再減小的趨勢，當乙醇體積分數為60%時，提取率達到最大值，此時的提取率為0.95%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳乙醇體積分數為60%。

2.1.3 提取時間 如圖1C所示，密花香薷總皂苷提取率隨著提取時間的增加呈現先增大再減小的趨勢，可能是因為提取時間過長，導致提取出的總皂苷又被水解。當提取時間為120 min時，提取率達到最大值，此時的提取率為1.17%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳提取時間為120 min。

2.1.4 提取溫度 如圖1D所示，密花香薷總皂苷提取率隨著提取溫度的增大呈現先增大再減小的趨勢，這可能是由于溫度過高，導致提取出的總皂苷被分解。當提取溫度為70 ℃時，提取率達到最大值，此時的提取率為1.19%。因此，選擇密花香薷總皂苷提取工藝的最佳提取溫度為70 ℃。

2.2 響應面法優化密花香薷總皂苷提取工藝試驗

選取上述單因素試驗中對密花香薷總皂苷提取率影響較大的3個因素：乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、提取溫度（C），以密花香薷總皂苷提取率（Y）為響應值，利用Box-Behnken響應面法試驗設計原理，進行試驗設計，試驗設計方案及結果如表2所示，利用 Design-Expert8.0.6軟件對表2結果進行回歸統計分析，所得回歸方程如下：

Y=-10.389 800+0.175 675A+0.048 608B+0.091 100C+0.000 008AB-0.000 050AC-0.000 067BC-0.001 403A2-0.000 178B2-0.000 578C2

為了檢驗此回歸方程的可靠性，進一步分析各因素對密花香薷總皂苷提取率的影響，對此回歸方程進行方差分析。由表3可知，該模型F=40.305 5，P<0.01（差異極顯著），表明差異具有統計學意義;失擬項的P=0.571 3>0.05（差異不顯著），表明差異無統計學意義;上述模型的P值及失擬項的P值說明該方程對試驗結果具有良好的擬合性，試驗誤差比較小。該方程的R2=0.981 1，說明此模型對本實驗結果具有較好的擬合性;R2adj=0.956 7說明該模型可解釋95.67%的響應值變化。

模型中的一次項A和B，二次項A2、B2和C2均小于0.05，說明乙醇體積分數、提取時間以及乙醇體積分數、提取時間、提取溫度的二次項對總皂苷提取率具有顯著影響;而提取溫度以及三因素的交互項顯著性較差，表明該試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。由表3的F值大小可推斷三因素對密花香薷總皂苷提取率影響的強弱，F值越大，說明影響越強，越小則越弱。因此，各因素對密花香薷總皂苷提取率影響的強弱為：提取時間>乙醇體積分數>提取溫度。

為了更直觀地看出各因素對密花香薷總皂苷提取率的影響，繪制了三維響應面圖，響應面圖坡度越陡峭，則說明試驗因素對密花香薷總皂苷提取率的影響越大。

圖2顯示，當乙醇體積分數在50%～62%，提取時間在90～125 min時，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇濃度及提取時間的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且提取時間曲面較乙醇體積分數曲面更為陡峭，說明提取時間較乙醇體積分數對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

圖3顯示，當乙醇體積分數在50%～62%，提取溫度在60～70 ℃時，密花香薷總皂苷提取率隨著乙醇濃度及提取溫度的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且乙醇體積分數曲面較提取溫度曲面更為陡峭，說明乙醇體積分數較提取溫度對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

圖4顯示，當提取時間在90～125 min，提取溫度在60～70 ℃時，密花香薷總皂苷提取率隨提取時間及提取溫度的增大而逐漸增大，之后則逐漸降低，且提取時間曲面較提取溫度曲面更為陡峭，說明提取時間較提取溫度對密花香薷總皂苷提取率影響更為顯著。

綜上所述，三因素對密花香薷總皂苷提取率的影響大小為：提取時間>乙醇體積分數>提取溫度，與表3結論一致。

經響應面法優化之后，得到的最佳提取工藝為：乙醇體積分數：61.77%、提取時間125.02 min、提取溫度68.99 ℃、液料比20∶1（體積質量比），此時密花香薷總皂苷提取率為1.22%?？紤]到實際操作的可行性，選取乙醇體積分數62.00%、提取時間125.00 min、提取溫度69.00 ℃、液料比20∶1（體積質量比），平行試驗3次，此時密花香薷總皂苷提取率為1.19%。與回歸方程的預測值1.21%相近，進一步證明了該回歸方程模型的可行性以及該提取工藝的穩定性。

2.3 密花香薷總皂苷抗氧化性

2.3.1 ABTS自由基清除率 由圖5可知，密花香薷總皂苷具有清除ABTS自由基的能力，且清除率隨著密花香薷總皂苷質量濃度的增加而增加，當密花香薷總皂苷質量濃度達到1.20 mg/ml時，ABTS自由基清除率達到71.54%，之后隨著密花香薷總皂苷質量濃度增加，清除率趨于平緩。此時，密花香薷總皂苷對ABTS自由基的半抑制質量濃度（IC50）為0.74 mg/ml。

2.3.2 DPPH自由基清除率 由圖6可知，密花香薷總皂苷具有清除DPPH自由基的能力，且清除率隨著密花香薷總皂苷質量濃度增加而增加，當密花香薷總皂苷質量濃度達到1.0 mg/ml時，DPPH自由基清除率達61.25%，之后隨著密花香薷總皂苷質量濃度增加，清除率趨于平緩。此時，密花香薷總皂苷對DPPH自由基的半抑制質量濃度（IC50）為0.56 mg/ml。

2.4 密花香薷總皂苷抑菌性

密花香薷總皂苷對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈直徑大小分別為2.74 cm、2.97 cm、1.27 cm，說明質量濃度為1.0 mg/ml 的密花香薷總皂苷溶液對細菌以及真菌均有一定的抑制作用。

3 結論

本試驗采用乙醇回流法對密花香薷總皂苷進行提取，用單因素試驗結合響應面法對提取工藝進行了優化，所得的最佳工藝為：乙醇體積分數62.00%、提取時間125.00 min、提取溫度69.00 ℃、液料比20∶1（體積質量比），此時的提取率為1.19%。試驗的實測值與模型的預測值差異較小，說明該方法具有較好的穩定性;采用ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法對密花香薷總皂苷的抗氧化活性進行評估，以維生素C為對照，結果表明密花香薷總皂苷具有較好的抗氧化活性，測定皂苷類物質的抗氧化活性方法較多，本試驗選擇的DPPH、ABTS自由基清除法操作較為簡便，所得數據較為直觀因而在測定活性成分的抗氧化性上被廣泛采用;以細菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）和真菌（酵母菌）對密花香薷總皂苷的提取液進行了抑菌活性測定，結果表明密花香薷總皂苷提取液對3種菌均有較明顯的抑菌活性。

皂苷類物質具有多種藥理活性，而目前對密花香薷總皂苷的研究較少，僅對密花香薷總皂苷進行了定性研究，本研究對青海西寧地區的密花香薷進行定量研究，并初步測定了所提取總皂苷的抗氧化活性及抑菌活性，為之后對密花香薷總皂苷的深入研究提供了試驗依據。

參考文獻：

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志：第66卷[M].北京：科學出版社， 1977：332.

[2] 中國科學院西北高原生物研究所. 藏藥志[M].西寧：青海人民出版社， 1991：227-229.

[3] 中國科學院西北高原生物研究所. 青海經濟植物志 （下） [M].西寧：青海人民出版社， 1997：487-488.

[4] 張 繼，王振恒，姚 健，等. 密花香薷揮發油成分的分析研究[J].草業學報， 2005， 14 （1） ：112-116.

[5] 包錦淵，李軍喬，張璐璐，等. 密花香薷有效成分的定性分析[J].北方園藝，2011，33（1）：202-204.

[6] 姜彥成，鄧彥斌，楊 箴，等. 密花香薷花蜜腺的解剖學研究[J].西北植物學報，1996，16（3）：239-244.

[7] ZHOU Y， LIAO F， WENG J， et al. Composition and acaricidal activity of essential oil from Elsholtzia densa Benth against Sarcoptes scabiei mites in vitro[J]. Veterinárnínterintna， 2019， 64：178-183.

[8] 石子林，李軍喬，王雅瓊，等.密花香薷多糖提取工藝優化及抗氧化活性研究[J].食品科技，2020，45（2）：231-236.

[9] 曹茜茜. 人參皂苷的抗齲保護作用初探[D].武漢：武漢大學，2018.

[10]黃煦杰，朱雅琴，馮楊洪，等. 鷹嘴豆總皂苷制備及體外降血糖與抗氧化活性評價[J].食品科技，2019，44（12）：253-259.

[11]王學芳，任紅賢，封穎璐. 人參皂苷單體的抗疲勞作用研究進展[J].解放軍醫藥雜志，2019，31（12）：114-116.

[12]王忠萍，張 靜，陳運中. 苦瓜總皂苷的響應面法提取條件及降血糖活性的研究[J].時珍國醫國藥，2019，30（12）：2845-2848.

[13]王曉娟， 謝 謙，劉 楊，等. 土家族藥物扣子七中三萜皂苷成分及抗腫瘤活性研究[J].中草藥，2020，51（7）：1831-1838.

（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-05-22

基金項目：國家自然科學基金項目（31660425）;2019年度青海省“高端創新人才千人計劃培養拔尖人才”項目;青海省自然科學基金項目（2019-ZJ-978Q）;青海民族大學2019年度校級理工自然科學項目 （2019XJG08）

作者簡介：石子林（1996-），男，湖北黃石人，碩士研究生，研究方向為藥用植物開發與利用。（E-mail）2424632465@qq.com

通訊作者：李軍喬，（E-mail）ljqlily2002@126.com