五酸鉀對酸雨脅迫傷害香青菜的緩解效應*

謝恩耀，衛 慢，陳俊彤，朱志平，袁振興，張 穎，錢加越，金 琎**

五酸鉀對酸雨脅迫傷害香青菜的緩解效應*

謝恩耀1,2，衛 慢1，陳俊彤1，朱志平1，袁振興1，張 穎1，錢加越1，金 琎1**

（1．蘇州科技大學化學生物與材料工程學院，蘇州 215009；2．上海微譜化工科技有限公司，上海 201403）

采用人工模擬酸雨的實驗設計，以國家農業地理標志產品香青菜（L.）為實驗材料，以葉片噴施蒸餾水為對照（CK），設置直接噴施pH3.0的酸雨（SY）和10mg·L?1濃度五酸鉀溶液預處理后再噴施pH3.0的酸雨（WS）兩個處理組。測定并比較分析各處理組香青菜根系活力、質膜透性（MP）、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧陰離子自由基產生速率和脯氨酸（PRO）含量，研究酸雨脅迫對香青菜主要生理指標的影響和五酸鉀對酸雨脅迫傷害香青菜的緩解效應，從而探索五酸鉀對酸雨脅迫下植物幼苗的防護效果。結果表明，葉面噴施濃度10mg·L?1的五酸鉀溶液能夠顯著提高酸雨脅迫下香青菜根系活力、CAT活性，保護了細胞質膜，有效降低香青菜體內PRO含量及超氧陰離子自由基產生速率。說明五酸鉀可緩解酸雨對香青菜的生理傷害，對提高香青菜抗酸雨傷害能力具有優良效果。

香青菜；酸雨脅迫；五酸鉀；理化指標；化控減災

酸雨污染發端于18世紀60年代的英國產業革命時期，其后拓展到歐洲、北美等地區。伴隨著工業化進程的加速，中國已躍然成為世界第三大酸雨區，年酸雨平均出現頻率高居全球第二且酸雨區面積達到總國土面積的12.6%[1]。酸雨對于中國農業發展的影響已經到了不容忽視的地步，其對農作物生長影響巨大，已有研究報道，酸雨可引起作物生理紊亂、生長不良、減產乃至死亡[2-5]。篩選培育抵御酸雨傷害的抗性作物品種，并采取一定的化控減災手段就顯得尤為必要。相較于新型作物品種篩選的漫長周期，當下使用外界化學防控手段在時間及效果上更為顯著，能夠更好地調節作物生理功能、增強作物抗逆性。因此，見效快、成本低的化控減災手段，更符合中國農業生產實際。

以往研究過程中，化控減災對農作物生長發育亦取得了不菲的成就。常青山等研究指出，在高羊茅[(Shreb) Darbysh.]種子發芽過程中添加適當劑量Ca2+浸種可減輕模擬酸雨對種子發芽勢和發芽率的影響[6]；唐麗發現，在酸雨脅迫過程中多種苗木脯氨酸（PRO）含量隨著酸雨pH值下降而大幅增加[7]，因此，PRO可以作為驗證酸雨脅迫下植物生理活動的一個重要指標；金琎等研究顯示，La3+可以有效緩解酸雨對玉米（L.）幼苗產生的不良影響，對酸雨脅迫下玉米幼苗根系、葉片生長起到促進作用[8]。使用La和Ce可減輕酸雨對供試植株代謝生理的損害，促進植株幼苗光合、呼吸作用并能有效提高抗氧化保護酶活性[9]。張玉濤等研究表明，除稀土外，多數抗酸雨脅迫的化學產品均含有絡合基團，有機物分子中配位官能團根據絡合能力的大小參與反應，從而對酸雨脅迫下的植株起到一定保護作用[10]。

稀土作為戰略儲備資源，將其用于農業生產的效價比相對較低，因此，尋找可替代的抗酸雨脅迫化學調節劑迫在眉睫，而新型化合物五酸鉀含有多個羧基與豐富的絡合基團，五酸鉀可吸收H+，釋放移動性較強的K+，同時能穩定細胞內金屬元素[11]。因此，從結構及原理上推測，五酸鉀能緩解一定強度酸雨對植物造成的脅迫傷害。

為此，本研究采用模擬酸雨（pH3.0）進行實驗設計，以國家農業地理標志產品香青菜（L.）為實驗材料，運用生理生化實驗技術，從細胞抗氧化傷害視角，初步研究酸雨脅迫對香青菜根系活力、質膜透性（MP）、過氧化氫酶（CAT）活性、氧自由基產生速率和脯氨酸（PRO）含量等5種生理生化指標的影響，以及噴施五酸鉀（10mg·L?1）對酸雨脅迫傷害香青菜上述指標的緩解效應，以期為酸雨危害的化控減災技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 試材培養

選用香青菜（L.）品種為黑葉香青菜，將其種子在質量分數為0.1%的氯化汞中消毒5min，后經去離子水沖洗，吸干表面水分，置三層紗布培養皿中，在恒溫培養箱中（溫度為26±1℃）萌發[12]。約7d后，待其根長達3cm時移入黑色塑料杯（直徑10cm）中并轉入光照培養室培養。

培養室溫度為25±3℃，光子通量密度為2000μmol·m?2·s?1，光暗比12h/12h，每杯2株，每2日換水一次[12]。至第二片真葉出現，改用1/2Hoagland營養液進行培育，早晚各通氣一次，并用去離子水補水以保證生長過程中水分充足，每3d更換一次培養液，培養30d后用于試驗處理。

1.2 試材處理

根據文獻[13]，按照SO42?:NO3?=4.8:1的體積比配制成濃度為1.0mol·L?1的AR母液，充分研究蘇州市土壤緩沖極限和機動車尾氣等外界條件影響[14-17]，最終在培育過程中在母液中加入蒸餾水經PHS-29A酸度計調節pH=3.0，以此溶液作為模擬酸雨。

五酸鉀（Potassium pyridine- 2,3,4,5,6 –pentacarboxylate），由蘇州科技大學化學生物與材料工程學院提供，其結構式為

前期預實驗已篩選出10mg·L?1濃度的五酸鉀對植物幼苗萌發具有最為顯著的效果，因此配制10mg·L?1五酸鉀溶液向香青菜噴施，以驗證對幼苗的酸雨防護效果。

選取萌發長勢一致的香青菜對其處理，共設置3個處理組，每個處理組設置5個平行處理，每個平行處理10株幼苗。對照組（CK）采取蒸餾水預噴施，24h后對其采用蒸餾水噴施處理；酸雨組（SY）采取蒸餾水預噴施，24h后對其采用pH=3.0的酸雨噴施處理；五酸鉀（WS）組采取10mg·L?1的五酸鉀溶液預噴施，24h后對其采用pH=3.0的酸雨噴施處理，每次噴施均宜將葉片全部打濕，用液量約為15mL。

對香青菜進行酸雨噴施處理24h后作為實驗第1天（記為1d），即開始相關指標測試，測試過程中分別對5組平行樣品進行同等測定，每組樣品設置3組平行以減少誤差，后續第6天（6d）、第11天（11d）、第16天（16d）分別測試并記錄相關生理指標。

1.3 指標測定

1.3.1 根系活力測定

選取香青菜幼苗根尖約5mm，單次采樣0.2g，在0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液中暗反應3h，以1mol·L?1硫酸終止反應，研磨后用乙酸乙酯定容，在485nm下比色，測定根系活力[18]，當3組平行樣的RSD≤15%時，取其均值進行數據統計，否則重新測定。

1.3.2 質膜透性（MP）及過氧化氫酶（CAT）活性測定

香青菜葉洗凈去葉脈后采用葉片打孔器制成1mm2左右葉片碎片，0.15g葉片放置在7mL去離子水中在抽真空環境下保持10min，通過電導率測定法對其MP參數進行測定[18]。利用H2O2在240nm處吸收的原理，將0.3g葉片在pH=7的緩沖液中充分研磨后取上清液，加入H2O2采用紫外吸收法對CAT活性進行檢測[19]。

1.3.3 超氧陰離子自由基產生速率及脯氨酸（PRO）含量測定

超氧陰離子自由基產生速率的測定過程參照羥胺氧化法[19]，實驗過程中稱取1g葉片充分研磨，將提取液和磷酸緩沖液、鹽酸羥胺充分反應，在加入對氨基苯磺酸和α-萘胺水浴后在530nm波長下測定其OD值用以得出超氧陰離子自由基含量；脯氨酸含量的測定參照茚三酮法[19]，取0.5g葉片充分研磨取其上清液，加入冰醋酸和酸性茚三酮水浴加熱，后續加入甲苯，在520nm處測定PRO含量。

1.4 數據統計與處理

數據處理采用SPSS 22計算平均值、標準差和相對值，單因素方差分析其差異性，最小顯著性差數法（LSD）進行顯著性檢驗，用Excel繪圖。

2 結果與分析

2.1 五酸鉀對酸雨脅迫下香青菜超氧陰離子自由基產生速率的影響

超氧陰離子自由基過度積累會造成植物體膜脂的過氧化作用，阻礙核酸合成，給植株造成不可逆轉的傷害[20]。從圖1可以看出，氧自由基產生速率隨著香青菜的生長發育總體呈現逐步升高的趨勢，在11d和16d時，酸雨組（SY）的氧自由基產生速率出現異常升高的現象，分別達到對照組（CK）的135%、142%，五酸鉀組（WS）的121%、114%，而隨著五酸鉀的施加，香青菜體內氧自由基產生速率得到了較為顯著的抑制（11d和16d）。

由此可見，隨著香青菜生長發育的后延，香青菜機體自身亦會衰老，因此氧自由基產生速率會隨著時間的增長而逐步增加，與此同時，酸雨脅迫環境對香青菜產生了一定程度的不利影響，加速了植物體的衰老進程。而五酸鉀的噴施則有效降低了香青菜機體中氧自由基的產生速率，雖然相較于對照組依然差異顯著，但總體來說五酸鉀依然起到了良好的保護作用。

注：小寫字母表示處理間在0.05水平上的差異顯著性。下同。

Note: Lowercase indicates the difference significance among treatments at 0.05 level. The same as below.

2.2 五酸鉀對酸雨脅迫下香青菜質膜透性（MP）的影響

細胞質膜是植物進行營養吸收和代謝廢物排放的一條重要通道，能夠輔助細胞更好地維持體內的離子平衡，在植物體內具有不可替代的作用[20]。在1、6、11和16d時，五酸鉀組（WS）MP分別為對照組（CK）的83.57%、95.56%、71.80%、90.54%，為酸雨組（SY）的80.62%、116.89%、51.59%、82.72%。從圖2可以看出，噴灑初期，酸雨并未對香青菜的MP產生較為顯著的影響，甚至6d時酸雨組（SY）電導率還有著較為顯著的降低。而在11d和16d時，五酸鉀組（WS）相對電導率均維持在相對較低的水平，而與此同時酸雨組（SY）的電導率則顯著高于對照組，達到了對照組的129.8%和117.6%，說明五酸鉀對細胞質膜具有可靠的修復作用，緩解了酸雨脅迫對香青菜細胞膜的損傷。

2.3 五酸鉀溶液對酸雨脅迫香青菜根系活力的影響

根系活力是衡量植物根系生理狀況、影響植株生長的重要指標[21]。圖3顯示，酸雨組（SY）噴灑酸雨1、6、11和16d時，香青菜苗的根系活力分別為對照組（CK）的55.70%、30.69%、30.83%和28.80%，酸雨對香青菜幼苗根系傷害顯著。而五酸鉀處理組（WS）其1、6、11和16d時根系活力均顯著高于酸雨處理組（S）（P<0.05），分別為酸雨組的190.37%、318.74%、352.81%和476.56%，且與CK處理中的根系活力水平基本一致，分別為對照組的106.04%、97.82%、108.77%和137.25%，差異均不顯著。說明噴施五酸鉀溶液對酸雨脅迫傷害香青菜有明顯緩解作用，且防護效應隨處理時間延長而增強，五酸鉀的施加達到了對香青菜根系保護的目的。

2.4 五酸鉀對酸雨脅迫下香青菜過氧化氫酶（CAT）活性的影響

CAT主要功能是對體內生理活動過程中產生的過氧化氫進行分解與清除，對細胞膜起到更好的保護作用，以減少植株體內產生的過氧化現象[22]。從圖4可以看出，酸雨組香青菜幼苗CAT活性出現了顯著的降低，而五酸鉀處理組不僅對酸雨脅迫的這種現象有所緩解而且還產生了更為優異的表現，五酸鉀組香青菜幼苗體內的CAT活性得到了顯著的提升，從而使得植株能夠更好地清除體內多余的過氧化氫。圖4表明，在1d和6d時，酸雨組（SY）CAT活性與對照組（CK）和五酸鉀組（WS）產生差異顯著，相較于二者分別升高了127.74%和43.79%，表明植物機體已經對酸雨脅迫環境作出了相關應答。到實驗后期(11d和16d)，酸雨組（SY）CAT活性顯著降低，五酸鉀組的CAT活性顯著提高，五酸鉀組的CAT活性為對照組的137.53%和140.33%，且達到了酸雨組的5.44倍和10.57倍。說明五酸鉀能夠很好地預防酸雨脅迫超過植物體自身應答閾值范圍，從而更好地用作農作物生產的化控減災。

2.5 五酸鉀對酸雨脅迫下香青菜脯氨酸含量（PRO）的影響

脯氨酸是一種相溶性滲透調節物質，在植株內能有效緩解細胞滲透壓異常的狀況，保護和提高酶類的生物活性，增強胞內穩定性[23]。由圖5可見，香青菜幼苗體內PRO含量總體呈現下降趨勢，結合上文結果分析可以推斷，香青菜幼苗生理生化活動受酸雨脅迫影響依舊處于其應答閾值范圍，酸雨所造成的脅迫效應在體內的抗氧化酶系統如CTA酶等調控下暫處于動態平衡。從圖5還可以看出，受到酸雨脅迫影響，酸雨組（SY）PRO值較對照組普遍出現了較為顯著的上升，而五酸鉀組（WS）則出現了顯著的降低，在16d時，五酸鉀組（WS）PRO含量分別是對照組和酸雨組的84.66%和81.85%。由此判斷，五酸鉀的施加可以為植物幼苗營造一個更加穩定的內環境，從而減少PRO的產生。

3 結論與討論

3.1 討論

受酸雨脅迫影響，酸雨組香青菜幼苗機能總體呈現下降趨勢。相較于對照組其超氧陰離子自由基產生速率、MP和PRO含量出現了較為顯著的增長，而香青菜根系活力和CAT活性均出現了顯著的降低。

植物體生理活性始終保持在一個動態平衡的過程中，本研究結果與王章艷等研究中的變化趨勢具有一定的相似度[13]，酸雨對植株幼苗的生理代謝過程產生了一定的氧化作用，從而造成植株體內超氧陰離子自由基含量顯著升高，而五酸鉀能夠提供羥基基團從而與部分氧化物質形成穩定的絡合物，在減少氧化物的同時能夠對植物細胞形成較為有效的防護層，從而有效提高植株的抗逆性。

酸雨脅迫隨著時間的推進開始從葉片向幼苗植株各個部位轉移，其積累的氧化物和胞內外滲透壓的變化對植物體的細胞產生傷害，進而植物體的MP會產生升高的現象。而本研究結果表現出先揚后抑的現象，與羅子渝等對冬青葉片中MP表現結果相悖[24]，這種現象出現的原因與植物體自身所具有的抗逆性有著一定的關聯性，培育過程中當酸雨脅迫環境未超出植物體自身修復作用的閾值時，植物自身會進行一定程度的應答反應[25]，本研究MP值在6d時出現峰值，隨后出現回落，隨著培育時間的延長，植物體轉運作用的影響下，噴施在葉片的酸雨被大幅轉運到根部，被植物體充分吸收從而造成植株體內生理環境紊亂，細胞質膜出現破裂，進而16d時MP又出現小幅上揚的現象，隨著研究時間的進一步延長，MP值變化趨勢與羅子渝等的研究結果相類似。

研究中根系活力在11d和16d時出現迅速降低的現象，分析原因是水培香青菜在超過30d會出現爛根的現象，因此后續實驗設計需增加通氣頻次。

隨著MP的提高，植株體作出了相應的應答，即進一步提高CAT活性及PRO含量來應對細胞內外滲透壓的變化，隨著培育時間的延長，為了應對體內代謝過程中所產生的氧化離子，消滅此類氧化物，香青菜幼苗體內CAT活性總體變化趨勢呈現逐步升高的趨勢，酸雨脅迫環境對這一生理過程產生了較為顯著的抑制作用，酸雨組CAT酶活性的降低是由于酸雨中的硫酸根離子氧化了環境中的部分離子，對CAT酶的關聯表達基因有著一定程度的抑制，最終造成CAT酶活性異常降低的現象。姚夢婕等相關研究發現[26]，施加少量稀土元素可以有效降低CAT酶活性，強烈的環境脅迫會致使細胞受損從而激發CAT活性。本實驗研究結果與其相反，綜合對照組CAT活性變化情況分析，造成此種結果的差異極大原因是由于不同實驗材料所造成的，香青菜對照組的CAT活性隨著時間的變化不斷增加，結合前人研究判斷，香青菜CAT活性依然處于植物自身閾值范圍[12]，五酸鉀的施加在其細胞閾值范圍內進一步增強了CAT活性從而更好地清除酸雨所造成的部分氧化物質，且在此借鑒林星谷等早年的研究成果，過氧化氫酶的關鍵表達基因在植株根、莖、葉、果之中均有不同程度的表達，但其在葉中的表達最低[27]，因此會造成一定的不利影響，從而使酸雨并未達到香青菜幼苗自身的應答閾值。因此，根據上述實驗結果可推斷五酸鉀的施加可以對香青菜抵抗酸雨脅迫起到有效的保護作用。

由五酸鉀處理組香青菜生理生化指標的變化可知，其CAT酶的活性有著十分顯著的提高，加強了植物體對酸雨脅迫的應答反應，究其原因，本實驗過程中所使用的新型化合物五酸鉀，其富含羥基基團，易發生絡合反應，可推斷當五酸鉀量達到一定濃度時，其能夠與重金屬離子產生強烈的絡合作用，從而形成性質穩定的絡合物改變環境離子的特性，在更好地對植物組織細胞提供保護作用的同時，亦是將CAT酶關鍵基因的阻遏離子給予清除從而使得其更好的表達，隨著CAT活性在香青菜閾值范圍內的不斷升高，香青菜幼苗體內ROS得以更好地清除，因酸雨脅迫而受損組織得到防護并逐步修復，使得機體內的氧自由基產生速率相較于酸雨組有著較為明顯的降低。與此同時MP指數有所下降，進一步聯動PRO含量降低。同時，五酸鉀對環境中的H+具有一定程度的交換作用，該過程中釋放出移動性較強的K+，從而彌補酸雨導致的大量K＋流失對植物造成的營養元素的匱乏，以此來提高植物幼苗的環境抗性。

PRO相關研究結果與王艷章等在對水稻研究過程所得結果有所出入[13]，但其用于維護植株體胞液平衡過程的作用原理與謝恩耀等研究所使用的植物生長調節劑相類似[28]。究其原因，五酸鉀中K+的釋放使植物體細胞內緩沖區間變大，加上抗氧化酶系的不斷作用使植物細胞內外滲透壓區域在一個較為穩定的波動區間內，因此PRO才會出現顯著的降低，從而更好地提高植物的抗逆性。

3.2 結論

（1）酸雨污染對香青菜幼苗產生顯著傷害，根系活力、CAT活性顯著降低，MP、PRO含量、超氧陰離子自由基產生速率顯著升高；（2）噴施五酸鉀可明顯緩解酸雨對香青菜幼苗的不利影響，其根系活力、CAT活性、MP、PRO、氧自由基產生速率在五酸鉀的作用下逐步恢復，能夠很好地提高植株幼苗自身的抗逆性；（3）五酸鉀緩解酸雨對香青菜生理傷害之效應，為酸雨危害的化控減災提供了一條新思路。

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Mitigative Effect of Pyridine-2,3,4,5,6-Pentacarboxylate on theL. under Acid Rain Stress

XIE En-yao1 2, WEI Man1, CHEN Jun-tong1, ZHU Zhi-ping1, YUAN Zhen-xing1, ZHANG Ying1, JIN Jin1

(1. School of Chemical Biology and Materials Engineering, Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009, China；2. Shanghai Weipu Chemical Technology Co., LTD, Shanghai 201403)

In this paper, the simulating acid rain (pH3.0) pollution was used,L., a national agricultural geographical indication product, regarded as the model material. The leaves which were sprayed distilled water regard as the control (CK). One treatment is the leaves were sprayed of pH 3.0 artificial acid rain (SY). Another treatment is the leaves were sprayed with 10mg·L?1Pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate solution and pH3.0 artificial acid rain (WS) in sequence. The root activity, plasma membrane permeability (MP), catalase (CAT) activity, oxygen free radical producing rate and proline (PRO) content were studied under the condition of acid rain stress and pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate protection. The results showed that the leaf which sprayed 10mg·L?1pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate solution could significantly improve the root activity and CAT activity, protect the cytoplasm membrane, and effectively reduce the PRO content and oxygen free radical production rate in broccoli under acid rain stress. The comprehensive comparison shows that pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate have a positive effect on relieving the physiological damage under the acid rain stress and improving the ability of resisting acid rain.

L.；Acid rain stress; Pyridine-2,3,4,5,6-pentacarboxylate; Physical and chemical indexes; Chemical control and disaster reduction

10.3969/j.issn.1000-6362.2021.03.005

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2020?08?25

蘇州市科技計劃項目（SYN201413）；江蘇省教育廳“高等學校大學生實踐創新訓練”（601630002）

金琎，副教授，研究方向為植物逆境生理學，酸雨、重金屬等對植物的損傷及其修復，E-mail: 871564458@qq.com

謝恩耀，E-mail:editortak@163.com