遺傳性視神經病變相關線粒體動力學和基因異常研究進展

彭小蓼,方 芳,彭 齡,姜文敏

（中南大學湘雅二醫(yī)院眼科，湖南 長沙410000）

遺傳性視神經性疾病臨床表現主要為無痛性、雙側或單側、緩慢性或快速進展性視力下降、視野缺損和視神經萎縮，甚至失明，同時可引起多器官并發(fā)癥，中樞神經系統最易受累［1］。該疾病主要分三類：①繼發(fā)于核DNA（nuclear DNA，nDNA）突變的常染色體顯性視神經萎縮（autosomal dominant optic atrophy，ADOA），其多有視神經異常及其他系統癥狀［2］；②線粒體DNA（mitochondrial DNA，Mt DNA）突變相關Leber遺 傳 性 視 神 經 病 （Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）［3］，為線粒體遺傳性眼病；③伴神經變性疾病的視神經萎縮，較少見［4］。參與線粒體動力學的蛋白質同時參與生命核心過程，例如細胞代謝，細胞凋亡或維持線粒體DNA，所涉及的具體機制尚不清楚，許多復雜疾病，如肥胖、1型或2型糖尿病、帕金森氏癥或阿爾茨海默病，均會伴發(fā)線粒體功能缺陷。既往研究［5］已發(fā)現大量線粒體動力學相關蛋白，但本課題組仍期待發(fā)現哺乳動物細胞中與線粒體分布和形狀相關的線粒體融合和裂變蛋白質，以便進一步確定其形態(tài)結構改變及其導致的基因突變誘導人類疾病發(fā)生的具體機制；同時可以將其作為靶向基因，推動疾病的預防和治療。

雖然目前已發(fā)現了大量參與線粒體動力學相關的基因突變可導致神經元變性，但均只是對其進行單一的闡述，并未將其統一歸納并總結線粒體動力學異常引起的神經元變性與視神經性疾病之間的相關性。本研究主要就線粒體動力學異常及其發(fā)生及遺傳性視神經病變的關系進行簡要概述。

1 線粒體結構、功能和動力學

線粒體是由2層膜包被的細胞器，因組織和細胞種類不同，其形態(tài)和分布亦各異，在能量需求高的細胞如神經元中富集［5］。線粒體具有許多重要的生理功能，如通過氧化磷酸化產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），吸收Ca2+和脂質，并通過細胞色素C釋放觸發(fā)細胞凋亡［6］。線粒體膜性結構分為線粒體外膜（outer mitochondrial membrane， OMM） 和 線 粒 體 內 膜 （inner mitochondrial membrane，IMM），是線粒體進行物質交換和維持自身穩(wěn)定性的基礎［7］。線粒體為維持自身結構的完整性和生物體的健康，不斷地進行融合與分裂，線粒體動力學主要包括線粒體融合與分裂，是維持線粒體形態(tài)、調節(jié)其分布和動態(tài)平衡的關鍵，其中發(fā)揮主要作用的是調節(jié)融合與分裂的蛋白質［8］。除維持自身穩(wěn)態(tài)外，線粒體還參與眾多細胞的生命過程，如在調控細胞的增殖、分化、凋亡和衰老等方面發(fā)揮重要作用［9］。其動力學異常幾乎與所有常見疾病的發(fā)生有關，病種涵蓋神經肌肉性疾病、眼部疾病和癌癥［10］。

1.1 線粒體融合蛋白線粒體融合受2種不同分子效應器調控：線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）、線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，MFN2）和視神經萎縮因子1（optic atrophy 1，OPA 1）［11］。MFN1/2介導OMM融合，OPA 1介導IMM融合［12］，兩者均為GTP酶，相互融合成蛋白復合物，構成線粒體融合核心。MFN-1和MFN-2為2種同源跨膜GTP酶蛋白，兩者結構相似：1個N端GTP結合結構域，第1個七肽重復序列，2個相鄰小跨膜結構域和C端第2個七肽重復序列，并共享相關功能域［13］。MFN可2次穿過線粒體外膜，跨膜時以不同復合物形式使MFN介導的線粒體融合在不同組織中有不同表達。研究［14-15］顯示：在小鼠胚胎發(fā)育過程中，MFN1高度表達，其余組織中均為MFN2表達更強且與GTP親和力更高，在神經元中該現象最為突出。MFN2具有多效性，參與調節(jié)線粒體運輸、有絲分裂和細胞生物學變化，并與許多病理變化相關，但尚未發(fā)現任何疾病與MFN1突變有關［16］。OPA 1是一種編碼960個氨基酸、類似動力蛋白的線粒體GTPase。OPA 1開放閱讀框由30個外顯子和8個轉錄變異體經3個外顯子選擇性剪接而產生，具有組織特異性。OPA 1在人類中廣泛表達，定位于線粒體膜間間腔（intermembrane space of mitochondrial，IMS）或緊密附著于線粒體內膜［12］。OPA 1包含1個GTPase結構域、1個動力蛋白中心區(qū)和C-末端結構域，共同參與OPA 1形成管狀結構和催化其生物活性。OPA 1首先合成其前體，在線粒體內經過蛋白水解，先離開IMS，錨定于IMM上，形成L-OPA，L-OPA 1經進一步水解，形成S-OPA 1。S-OPA 1與L-OPA 1在線粒體嵴交界處相互作用，與線粒體接觸位點及嵴組織系統亞基相互作用，穩(wěn)定線粒體結構及嵴的形成。L-OPA 1負責線粒體融合，S-OPA 1參與線粒體內膜分裂，提示OPA 1在線粒體中具有融合與分裂的雙重調控作用［17］。除此之外，OPA 1在維持膜電位、穩(wěn)定鈣離子和呼吸鏈復合物的組裝中均發(fā)揮重要作用［5］。OPA 1通過穩(wěn)定線粒體嵴和利于ATP合酶寡聚化來保護線粒體免受呼吸鏈抑制［18］。MFN1與MFN2和OPA 1的一級序列高度相似［19］，在線粒體融合中共同發(fā)揮作用。

1.2 線粒體分裂蛋白分裂的原理是通過外膜的發(fā)動蛋白相關蛋白1（dynamin related protein 1，DRP1）/dynamin 1（DNM 1L）寡聚作用，將線粒體分成2個新的線粒體［12］。DRP1主要位于細胞質，是線粒體和過氧化物酶體裂變主要動力蛋白，因DRP1抑制降低細胞進入程序性細胞死亡易感性，線粒體分裂過多可能是細胞凋亡早期跡象［20］。人DRP1經典發(fā)動蛋白結構域為GTP酶結構域、中間結構域、修飾結構域和1個不明確區(qū)域（發(fā)散域）。定點誘變和DRP1嵌合體的產生證明了這些結構域在DRP1對線粒體和過氧化物酶體裂變調節(jié)的重要性，任一結構域缺失均會削弱蛋白質的該功能［21］。由于DRP1是一種細胞質蛋白，其必須通過DRP1受體進入OMM、線粒體動力蛋白49（mitochondrial dynamics proteins 49，MID49）、線粒體動力蛋白51（mitochondrial dynamics proteins 51，MID51）及線粒體裂變因子（mitochondrial fission factor，MFF）［22］。MFF是確定進入軸突的線粒體大小和形狀的關鍵因子，并在軸突遠端維持線粒體結構穩(wěn)定。MFF表達下調時，突觸前膜對Ca2+的攝取增加，導致突出前膜Ca2+聚積減少，軸突釋放神經遞質減少，最終引起神經功能退化［23］。研究［24］顯示：線粒體動態(tài)蛋白在融合和分裂中的作用分界不是特別明顯，如線粒體融合蛋白OPA 1可以調節(jié)線粒體分裂。

2 線粒體動力學異常與遺傳性視神經萎縮的關系

線粒體是在神經元中發(fā)現的最豐富的細胞器之一，分布于軸突和樹突狀細胞。研究［23］顯示：樹突狀線粒體呈長管狀，主要在神經退行性疾病和維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用；而軸突線粒體則呈點狀，有助于ATP的產生，并在突出傳遞過程中起緩沖Ca2+的作用。視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGC）胞體位于視網膜神經節(jié)細胞層，其樹突可投射至內叢狀層，與其他視網膜神經元建立聯系，長軸突延著視神經延伸，與大腦內細胞連接，將信號從視網膜傳輸至大腦［25］。在視網膜內與大腦突觸的活躍部位，需要大量能量合成神經遞質、突觸小泡、穩(wěn)定離子梯度及緩沖鈣。ATP形式的能量是RGC軸突雙向運輸所必需。與篩板遠端的有髓神經纖維比較，RGC軸突無髓鞘神經纖維因缺乏跳躍性，需要更多ATP產生動作電位。在人體中，這部分線粒體居多，神經元線粒體的位置和活動性依賴于微管和肌動蛋白細胞骨架的相互作用，這保證了其在胞體和軸突之間的分布，并沿著軸突和樹突運輸，在神經末梢和突觸部位有足夠數量的存在，線粒體活動性和分布的缺陷與神經元功能障礙疾病直接相關［26］。線粒體膜動力損傷可導致突觸功能障礙、樹突和軸突變性及RGC選擇性死亡，引起相關視神經病變［27］。

2.1 MFN2突變MFN2突變可引起Charcot-Marie-Tooth（CMT）疾病亦稱為遺傳性運動和感覺 神 經 性 疾 病 （hereditary motor sensory neuropathies，HMSNs），為最常見的遺傳性視神經病變［12］。其中MFN 2突變引起的CMT 2A型為CMT最常見類型，占20%，其突變?yōu)檩S突突變［28］，大多數在MFN2 GTP酶結構域中，MFN 2其他區(qū)域亦可發(fā)現突變體：①NH 2末端Ras結構域或其附近發(fā)現5個突變；②第1個七肽重復序列附近發(fā)現12個突變點；③COOH末端HR2區(qū)域4個突變，其突變主要為錯義突變，并伴有多個mtDNA缺失。CMT 2A是一種以復雜表型為特征的神經系統疾病，以早發(fā)性視神經萎縮、神經性相關癥狀和線粒體肌病為特征，其中HMSNⅥ型與視神經萎縮和青光眼的發(fā)病相關［29］。MFN2突變引起線粒體融合缺陷可通過MFN1表達挽救［30］。

2.2 OPA1突變OPA 1是最早被確定、也是引起ADOA最常見的基因，占ADOA的60%～80%，其中20%患者存在眼外器官受累，以耳聾最常見［31］。OPA 1突變形式主要有2種：一種是OPA 1中內含子4b的深內含子突變，通過激活1個隱匿的剪接位點導致內含子4b部分解離和閱讀框移位，Alu序列錯誤剪接，從而跳過第8外顯子而導致ADOA；二是基因內修飾物突變，主要為C.610+364G＞A及C.1311A＞G/P.1437M突變。C.610+364G＞A為表型修飾變異體，較常見，由GONZALE等［32］發(fā)現，其主要由5個受位體向上游移動4個核苷酸導致下游序列無65bp/97bp或61bp/93bp無連接，臨床表現為雙側視神經萎縮、小腦共濟失調及周圍神經病變，常無耳聾表現。C.1311A＞G/P.1437M突變?yōu)殄e位插入，其本身不致病，常作為表型修飾因子，與第2個OPA 1反式突變或與C.610+364G＞A等位基因聯合突變導致多系統退行性病變，兒童時期即可引起雙側視神經萎縮及其他神經系統癥狀。

2.3 DRP1突變DRP1主要通過其受體MFF突變引起病變，迄今發(fā)現的MFF突變患者僅數例，且所有患者早期即有Leigh樣腦病表現。NASCA等［33］發(fā)現1例患Leigh樣腦病的11歲男孩，表現為神經功能退化、癲癇性肌陣攣發(fā)作、嚴重智力障礙、小頭畸形、四肢癱瘓、視神經萎縮和眼肌麻痹，線粒體疾病基因組分析顯示MFF基因中純合c.892C＞T。1例新生女孩患者表現為小頭畸形，大腦發(fā)育異常，視神經萎縮，持續(xù)性乳酸血癥及極長鏈脂肪酸血漿濃度輕度升高，其成纖維細胞中出現線粒體缺陷和過氧化物酶體裂變，遺傳分析結果提示DRP1雜合錯義突變，定位于蛋白質中間區(qū)域的保守氨基酸。DRP1突變?yōu)轱@性突變，并在成纖維細胞中表達后抑制過氧化物酶體和線粒體裂變。其機制可能與這種抑制可通過在膜上形成螺旋環(huán)所需DRP1的初始寡聚化的可能缺陷有關［34］。研究［35］顯示：線粒體分裂抑制劑P110是一種新型選擇性肽抑制劑，在體外通過抑制DRP1酶活性來阻斷DRP1/FIS1的相互作用并通過抑制活性氧的產生保證線粒體膜電位和線粒體結構穩(wěn)定性，發(fā)揮神經保護作用；同時P110通過減少細胞凋亡和自噬細胞死亡來增加神經元的活力，并減少初級神經元損傷，有助于治療線粒體過度分裂和線粒體功能障礙所引發(fā)的疾病。

2.4 其他突變基因其他突變基因包括OPA 3（opticatrophy3）、SPG7（spastic paraplegin gene 7）、AFG3L 2（ATPase family 3-like gene）、YME1L 1（yeast mitochondrial escape 1-like 1）、SLC25A 46（solute carrier family 25 member 46）和RTN4IP1（reticulon 4 interacting protein 1）等。OPA 3多位于IMM，少部分位于OMM，主要參與調節(jié)線粒體結構［36］。REYNIER等［36］發(fā)現：患病家族中OPA 3相關C.277G＞A或C.235C＞G突變表現為視神經萎縮和白內障，呈常染色體顯性遺傳。SPG7與AFG3L2為m-AAA蛋白酶，在IMM上形成異源寡聚蛋白復合物［37］，負責線粒體核糖體蛋白L 32和OPA 1蛋白水解，通過調節(jié)OPA 1而發(fā)揮重要作用。MAGRI等［38］研究1例以早發(fā)性視神經萎縮伴痙攣性共濟失調和左旋多巴胺性帕金森病為特征的患者的基因發(fā)現：其存在SPG7缺失及AFG3L 2 p.R468C雜合突變。SPG7突變癥狀與OPA 1突變類似，但常于10歲前發(fā)病，同時SPG7是常染色體隱性遺傳性痙攣性截癱的致病因素。AFG3L2主要是arg468cysc序列突變，表現為嬰兒時期雙側對稱性視力喪失，伴智力低下。另外，AFG3L2基因雜合錯義突變是導致常染色體遺傳性脊髓小腦共濟失調28型的重要原因，其中純合子AFG3L2突變者臨床表現更嚴重。YME1L 1是一種核基因編碼的ATP依賴性金屬蛋白酶，常嵌入IMM，通過加速L-OPA 1裂解或改變DRP1破壞線粒體功能，是YME1L 1突變導致視神經病變的主要機制［5］。同時YME1L影響復合體Ⅰ，可導致生物氧化功能障礙。YME1L 1與影響復合體Ⅳ的AFG3L 2具有協同作用，將兩者均行基因敲除，導致OPA 1過表達和SPG7亞基嚴重降低［39］。SLC25A 46屬于SLC25家族線粒體載體蛋白，負責不同底物在IMM間轉移，通過調節(jié)IMM上的OPA 1和MFN2發(fā)揮作用，是線粒體膜動力所必需［40］。研究［5］顯示：在視神經萎縮綜合征患者中發(fā)現了隱性SLC25A 46突變，該綜合征被稱為遺傳性運動和感覺神經病ⅥB型，其臨床表現范圍廣泛，包括早發(fā)性視神經萎縮、周圍神經病變和小腦變性。CHARIF等［41］發(fā)現：編碼線粒體醌氧化還原酶RTN 4IP1基因突變可出現孤立性視神經萎縮癥狀或綜合性神經系統表現。

2.5 線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）mtDNA突變是呈雙鏈環(huán)狀的遺傳物質，1個線粒體中可有1個或數個mtDNA分子，因物種不同其長度和基因大小各異。人類mtDNA長度為16 569 bp，含37個基因，編碼2種rRNA、22種tRNA及13種多肽（呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ亞基）［42］。LHON是最常見的母系遺傳性Mt DNA疾病，以青年男性多見，常雙眼先后發(fā)病［43］。病變主要由3種mtDNA突變引起：m.11778G＞A、m.3460G＞A和m.14484T＞C，占LHON的90%以上，上述基因突變影響線粒體復合物I，損傷視網膜神經節(jié)細胞和視神經功能［40，44］，其中m.11778G＞A突變最常見，但預后較差［45］。研究［46］顯示：多數患者具有m.11778G＞A與m.14484T＞C這2個位點突變，患者在兒童期便出現輕至中度視力喪失，并發(fā)現m.14484T＞C突變與發(fā)病年齡有較高相關性，且發(fā)病年齡更早有更復雜的功能障礙，表明2個位點突變具有協同效應。對4例存在雙基因突變患者的家族研究［47］顯示：患者均為男性，在約20歲時出現視力降低，其他未出現雙基因突變的兄弟發(fā)病時間較晚，且其家族中女性無任何癥狀。除上述3個主要突變點外，還存在其他次要位點：C3497T、C3571T及T 3866C，通過協助其他基因突變引起LHON。患LHON的2個家系mtDNA研究中發(fā)現除了存在11778G＞A突變，在MT-ND1基因有2個次級突變點C3497T和C3571T，其與11778G＞A協同破壞呼吸鏈，影響線粒體功能［2］。T 3866C突變導致蘇氨酸取代187位異亮氨酸（位于ND1多肽跨膜結構域高度保守序列），改變復合物I活性，導致與LHON和肢體異常跛行相關線粒體功能障礙［48］。m.3394T＞C位于MT-ND1，其突變破壞了p.MT-ND1和復合物I組裝穩(wěn)定性，降低氧化活性及影響線粒體功能［49］。研究［50］顯示：僅有m.3394T＞C突變者LHON發(fā)病率極低，而m.3394T＞C突變及m.11778G＞A或者m.14484 T＞C突變患者表現出比攜帶單個任何mt DNA突變更高的外顯率，具有更大的線粒體功能障礙。

3 展 望

綜上所述，遺傳性視神經性疾病是由各種原因引起的遺傳多樣性疾病，其主要病因是視網膜神經節(jié)細胞受到廣泛損害，最終導致視神經退行性病變。線粒體動力學異常和Mt DNA突變在遺傳性視神經退行性疾病的發(fā)病機制中起重要作用。這可能與視網膜神經節(jié)細胞的高耗氧特性使其對線粒體功能障礙異常敏感高度相關。因此線粒體動力學研究是具有挑戰(zhàn)性的研究領域。