檢測β?CTX和N?MID水平的雙標記時間分辨免疫熒光分析方法的建立和評價

毛 騫,陳翠翠,梁煥坤,劉鵬娥,鐘樹海,李來慶

（1.北華大學附屬醫院內分泌科，吉林 吉林132001；2.廣州優迪生物科技股份有限公司，廣東 廣州510663）

近年來，骨質疏松癥發病率不斷升高，嚴重威脅人們的健康和生命安全［1］。骨質疏松癥早期常不能引起人們的注意和重視，就診時病情嚴重甚至已發生骨折。目前主要采用雙能X線吸收儀（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）測定骨密度來診斷骨質疏松癥，但存在價格昂貴、操作繁瑣和普及率低等不足，在基層難以推廣應用［2-3］。因此，早期快速、準確、敏感和定量診斷對預防和監測骨質疏松癥具有重要意義。β膠聯降解產物又稱Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（β-cross-linked C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX），是骨重建過程中膠原被降解后釋放入血的片段，β-CTX水平的升高反映了骨吸收程度、骨質流失增加，以致骨質疏松癥和變形性骨病的發生。β-CTX與骨轉換或骨礦物質密度（bone mineral density，BMD）等標志物之間存在相關性，是診斷骨轉移的潛在標志物［4-5］。骨鈣素可直接反映骨形成的狀況，但血液標本放在室溫下1 h后，骨鈣素即會大量降解，其降解產物骨鈣素N端中分子片段 （N-terminal middle molecular fragment of osteocalein，N-MID）因其具有良好的穩定性和重復性，可代替骨鈣素反映骨形成狀態［6］。因此，N-MID常應用于骨質疏松癥的臨床療效觀察和預后判斷［7-8］。本研究在國內首次建立了β-CTX和N-MID水平雙標記的時間分辨免疫熒光分析（double-labeled time-resolved immunofluorescence analysis，TRFIA）法，以ELISA檢測結果作為金標準進行對比，為快速、精準篩查或監測骨質疏松癥提供了新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 抗體、試劑和儀器

抗β-CTX和N-MID單克隆抗體（MAb）4E5和2B7（包被抗體）、2G6和5A 3（檢測抗體）和β-CTX和N-MID標準抗原均由廣州優迪生物科技股份有限公司制備，銪離子（Eu3+）和釤離子（Sm3+）標記試劑盒（美國PerkinElmer公司），牛血清白蛋白（美國Fitzgerald公司），Sephades-G50填料（美國GE公司），96孔培養板（美國Costar公司），包被緩沖液、洗滌液、封閉液和增強液均為自制。Victor 1420全自動時間分辨熒光免疫分析檢測儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 固相包被抗體的制備和檢測抗體的標記

將構建好的包被抗體采用緩沖液稀釋至10 mg·L－1，按每孔100μL加入96孔微孔板中包被，4℃過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔250μL，37℃封閉2 h，棄掉封閉液，洗滌液洗滌2次，真空冷凍抽干，于－20℃保存備用。按照試劑盒說明書，采用Eu3+和Sm3+標記試劑盒進行抗體標記。

1.3 標準品的制備

采用Tris-HCl緩沖液（pH 7.8），將β-CTX抗原配制成濃度為0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5和5.0μg·L－1的系列標準品溶液，將N-MID抗原配制成濃度為0、10、20、80、160和200μg·L－1的系列標準品溶液。

1.4 TRFIA方法檢測性能評估

1.4.1 靈敏度和特異度檢測 采用“1.3”步驟中制備的β-CTX系列標準品繪制標準曲線，以0μg·L－1β-CTX標準品為樣本，將其測定的20次熒光值均值（mean）加上2倍的標準差（2SD）代入標準曲線方程，計算TRFIA方法的靈敏度。采用“1.3”步驟中制備的N-MID系列標準品繪制標準曲線，繪制方法同β-CTX標準品。

特異度檢測：同時檢測β-CTX標準品、N-MID標準品、Ⅰ型膠原蛋白氨基末端肽（N-terminal peptide of collagen typeⅠ，NTX）、抗酒石酸酸性磷 酸 酶 （tartrate resisitant acid phosphatase，TRACP）、生長激素（growth hormone，GH）、骨特異性堿性磷酸酶（bonespecific alkalinephosphatase，BACP）、骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）和甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）水平。

1.4.2 準確度和精密度實驗 對濃度已知的3個β-CTX和N-MID標準品分別按1∶2、1∶4和1∶8濃度倍比稀釋，每個樣本重復檢測3次，比較樣本的測定值、真值并計算其比值（稀釋回收率）。

將β-CTX和N-MID標準品分別稀釋至高、中和低3個濃度，每個濃度各設3個復孔，重復檢測10次，對測定結果進行分析。

1.4.3 穩定性實驗 采用本研究制備的TRFIA試劑盒置于4℃冰箱6個月和37℃、7 d，對試劑盒的物理外觀，劑量-反應曲線的線性、靈敏度、準確度和特異度等指標進行測定，具體檢測方法同“1.4.1”和“1.4.2”步驟。

1.5 臨床樣本對比檢測

收集2018年3月—2019年3月北華大學附屬醫院X射線骨密度儀確診的骨質疏松癥患者晨起空腹血清和對應健康成人的晨起空腹血清。骨質疏松癥患者分為青少年組（15例）、妊娠期婦女組（22例）、絕經期婦女組（26例）和老年人組（31例），陰性樣本為對應年齡段的非骨質疏松的健康者。β-CTX和N-MID分別采用TRFIA法、化學發光法和ELISA法進行比對試驗，分析評價其對骨質疏松癥的檢測效果。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。平行測定10次0μg·L－1參考標準品的熒光值，計算其標準差，并代入標準曲線計算靈敏度，采用Graph Pad Prism 5統計軟件計算標準曲線方程，采用Origin 8軟件繪圖。

2 結 果

2.1 TRFIA的最佳反應條件

經過優化，最終確定TRFIA最佳的反應條件：β-CTX和N-MID包被抗體的濃度為10 mg·L－1，每孔100μL和8 mg·L－1，每孔100μL；Eu3+標記試劑：標記抗體最佳比例為70μL∶30μL；Sm3+標記試劑：標記抗體最佳比例為75μL∶25μL；反應體系為25μL標準品或待測樣品+200μL分析緩沖液+每孔200μL Eu3+（或Sm3+）-檢測抗體+每孔200μL增強液。

2.2 靈敏度和特異度實驗結果

β-CTX方程：Y=0.998 8X+0.857 6，R2=0.999 4，線性范圍 為0.025～5.000μg·L－1；N-MID方程：Y=0.033 0X+0.621 1，R2=0.999 4，線性范圍為0.5～200.0μg·L－1。平行測定10次0μg·L－1參考標準品的熒光值，并計算其均值（mean）及標準差（SD），采用mean+2SD代入標準曲線方程，計算出TRFIA法對β-CTX的檢測靈敏度為0.025μg·L－1，TRFIA法對N-MID的 檢 測 靈 敏 度 為0.5μg·L－1。同 步 檢 測NTX、TRACP、GH、BALP、OPG和PTH均為陰性，無明顯交叉反應表明該試劑盒特異性良好。繪制的標準曲線見圖1。

2.3 準確度和精密度實驗結果

β-CTX的3個樣品3個水平稀釋度的稀釋回收率為98.6%～104.6%，N-MID的3個樣品3個水平稀釋度的稀釋回收率為98.9%～105.6%（表1），稀釋倍數與濃度呈線性關系。批內變異系數（CV）為5.81%～7.82%，β-CTX批間CV為5.97%～8.02%；N-MID批內CV為6.05%～8.32%，批間CV為6.14%～8.56%（表2）。批內和批間CV均小于10%，符合臨床檢測試劑盒要求。

2.4 穩定性實驗結果

試劑盒置于4℃冰箱能穩定保存6個月以上，37℃熱破壞性試驗能穩定保存7 d以上，說明該TRFIA方法制備的試劑盒穩定性較好。見表3。

2.5 臨床樣本的對比檢測結果

將制備的雙標記檢測試劑盒與CLIA和ELISA法同時檢測94例骨質疏松癥患者和94例非骨質疏松癥健康者的血清，TRFIA法與CLIA和ELISA法檢測結果一致，3種檢測方法的符合率為100%（表4），表明本研究建立的TRFIA方法可快速、準確和定量地檢測β-CTX和N-MID臨床樣本。

圖1 TRFIA試劑盒的標準曲線Fig.1 Standard curves of TRFIA Kit

表1 TRFIA試劑盒的稀釋回收率Tab.1 Dilution recovery rates of TRFIA Kit

3 討 論

TRFIA是一種理想的免疫測定方法，已廣泛應用于各個領域，如臨床研究、分子生物學、藥物分析和病毒的檢測［9-12］。采用鑭系元素螯合物時，由于發射波長和動力學不同，非特異性背景和特異性信號的時間分辨熒光有區別，因而能夠采用Eu3+和Sm3+螯合物開發雙標簽TRFIA，從而可以同時檢測2種分子［13-15］。

骨質疏松相關的骨折風險通常通過BMD評估，但是由于骨強度也由其他因素決定，如骨幾何形狀、微結構和大小，因此BMD本身并不是骨折風險的良好預測指標［16-17］。目前，骨轉換的生化標志物正被用于預測骨質流失的速度和評估老年人骨折的風險。可以通過確定代表骨重塑過程的某些蛋白質的血清或尿液濃度來估計骨轉換率［18］。這些蛋白質可以分為骨形成標記和骨吸收標記，最具特異性和最敏感的骨形成標記物包括β-CTX和N-MID［19-21］。

表2 TRFIA試劑盒檢測的精密度T ab.2 Precision of T RFIA Kit detection

表3 TRFIA試劑盒檢測的穩定性Tab.3 Stabilities of TRFIA Kit detection

本研究擬采用Eu3+標記抗β-CTX單克隆抗體和Sm3+標記抗N-MID單克隆抗體，采用雙抗體夾心法建立β-CTX/N-MID雙標記TRFIA試劑，自行研制能同時檢測人血液β-CTX和N-MID的TRFIA試劑盒，本研究所研制的試劑盒檢測結果顯示：β-CTX的檢測靈敏度為0.025μg·L－1、N-MID的檢測靈敏度為0.5μg·L－1，定量線性范圍β-CTX在0.05～5.00μg·L－1、N-MID的線性范圍為0.5～200.0μg·L－1，檢測范圍寬。β-CTX平均稀釋回收率為102.13%，N-MID平均稀釋回收率為103.02%，與其他常見骨檢測指標無明顯交叉反應，特異性較強；β-CTX批內CV為5.81%～7.82%，批間CV為5.97%～8.02%；N-MID批內CV為6.05%～8.32%，批間CV為6.14%～8.56%，達到臨床測試要求（批內CV＜10%，批間CV＜15%）。此外，雙標記試劑盒可在4℃穩定保存6個月，37℃穩定保存7 d，這使該雙標記TRFIA成為本方法的良好替代品。

表4 TRFIA試劑盒、CLIA和ELISA法對臨床樣本的對比檢測結果Tab.4 Comparison test results of clinical samples detected by TRFIA Kit,CLIA,and ELISA methods

本項目研發的檢測試劑盒可同時檢測單個樣本中的β-CTX和N-MID水平，集中了TRFIA敏感、定量、簡便和快速的優勢，更適于廣泛推廣，特別適合于基層無法開展儀器檢測的實驗室。本試劑盒的應用將有利于推動檢測基層和城鎮血清樣品中β-CTX和N-MID水平的檢測，使該檢測項目成為一個常規的普查項目或者家庭式的自檢項目，從而更有效地預防骨質疏松癥的發生發展。