1株重組H6N2禽流感病毒全基因組特征分析

曹 藍，夏 丹，劉艷慧，曾 慶，陳藝韻，陸劍云，李魁彪，張周斌，狄 飚

禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒，根據病毒表面抗原血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同，分為不同亞型：H1～H16；N1～N9[1]，2011—2016年我國家禽禽流感病毒監測顯示，近年我國H6亞型禽流感病毒的流行呈上升趨勢[2]，同時該亞型也是我國南方地區家禽常見的禽流感病毒亞型之一[3]。研究顯示，我國早期H6亞型禽流感病毒主要為H6N1和H6N2[4]，近期主要流行亞型為H6N2和H6N6[5]。前期監測發現，近年來廣州地區H6亞型禽流感病毒雖為禽源本地化病毒，但HA基因已出現較大變異，同源性在81.0%～99.1%之間[6]，其中大部分毒株分布在ST2853-like分支，僅有1株病毒分布在ST339-like分支。因此，本研究選取ST339-like分支的A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)病毒進行全基因組序列分析，對全面掌握廣州地區H6亞型禽流感病毒的流行和變異情況有著重要的公共衛生意義。

1 材料與方法

1.1毒株來源 A/EN/Guanghzou/13565/2018(H6N2)毒株于2018年分離自廣州活禽市場外環境，通過雞胚接種進行病毒的分離和純化，通過熒光定量RT-PCR方法對禽流感病毒各亞型進行核酸檢測，鑒定為H6N2亞型禽流感病毒，將雞胚尿囊液分裝于-80 ℃冰箱長期保存。

1.2基因測序 參考NCBI數據庫中H6N2亞型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全基因組序列，應用Oligo 6軟件設計各基因片段全長擴增引物(表1)，引物由廣州天一輝遠生物公司合成。通過反轉錄和RT-PCR擴增，經毛細管電泳對基因片段大小進行鑒定后，將陽性擴增產物送至廣州天一輝遠生物公司，利用ABI 3730測序儀對毒株基因組進行一代(毛細管)測序。

1.3遺傳進化分析 應用DNA Star7.1軟件拼接各基因序列。應用NCBI數據庫進行各基因BLAST比對，分析基因(氨基酸)最大相似性毒株。采用MEGA 4.0軟件，以基因ORF為基本單元，參照參考文獻[7]選取禽流感代表株作為參比序列，繪制HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS各基因片段基因系統進化樹。繪制方法為Neighbor-joining法(參數設置為1000 replications)及Maximum composite likelihood model比對核苷酸序列。

表1 H6N2禽流感病毒各基因片段擴增引物Tab.1 Amplification primers for gene fragments of the avian influenza A (H6N2) virus

1.4分子特征分析 應用BioEdit軟件對HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M1、M2、NS1蛋白重要氨基酸位點進行突變分析。

2 結 果

2.1同源性比較 經BLAST比對，A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)毒株各基因片段核苷酸最大相似度毒株均為國內H6N2禽流感病毒，最大相似性在96.85%～98.22%之間。氨基酸最大相似性毒株大部分為華南地區的H6N2、H6N6毒株，其中PB2蛋白與A/duck/Guangdong/W12/2011(H3N2)同源性最高，各蛋白氨基酸最大相似性在96.30%～99.30%之間，見表2。

表2 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)各基因核苷酸和氨基酸最大相似性毒株列表Tab.2 List of strains with the greatest nucleotide and amino acid similarity for each gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

2.2遺傳進化特征 H6N2禽流感病毒各基因片段均屬于歐亞譜系(Eurasian Lineage)，HA基因與A/duck/Shantou/339/2000(H6N2)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支；NA基因與A/duck/Guangdong/S1328/2010(H6N2)親緣關系較近，在HxN2不同亞型基因中歸屬于H6N2分支；PB2基因與A/duck/Guangxi/2281/2007(H6N6)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支；PB1基因與A/duck/Shantou/2962/2007(H6N6)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支；PA基因與A/duck/Shantou/7429/2006(H6N6)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支；NP基因與A/duck/Shantou/2962/2007(H6N6)親緣關系較近，歸屬于HN573-like分支；M基因與A/duck/Shantou/339/2000(H6N2)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支；NS1基因與A/duck/Guangxi/3574/2006(H6N2)親緣關系較近，歸屬于ST339-like分支，見圖1～8。

圖1 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)HA基因遺傳進化樹Fig.1 Genetic evolution analysis of the HA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖2 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NA基因遺傳進化樹Fig.2 Genetic evolution analysis of the NA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖3 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PB2基因遺傳進化樹Fig.3 Genetic evolution analysis of the PB2 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖4 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PB1基因遺傳進化樹Fig.4 Genetic evolution analysis of the PB1 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖5 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)PA基因遺傳進化樹Fig.5 Genetic evolution analysis of the PA gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖6 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NP基因遺傳進化樹Fig.6 Genetic evolution analysis of the NP gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖7 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)M基因遺傳進化樹Fig.7 Genetic evolution analysis of the M gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

圖8 A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)NS1基因遺傳進化樹Fig.8 Genetic evolution analysis of the NS1 gene of A/EN/Guangzhou/13565/2018 (H6N2)

2.3分子特征 在HA蛋白226和228位受體結合位點上，表現為226Q和228G，顯示該病毒優先結合禽源受體，在HA1和HA2連接處的裂解位點序列為RQIETR/GLF，只有一個堿性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒基因序列。NA蛋白274和292位耐藥位點上，表現為274H和292R，提示該病毒對神經氨酸酶抑制劑敏感。NA基因共編碼469個氨基酸，頸部未發生與毒力變化相關的氨基酸缺失。在PB2蛋白89位，該病毒發生與增加小鼠致病性相關的L89V突變，在增加對哺乳動物傳播能力的627和701位，未發生突變。在哺乳動物細胞中復制相關的PB1蛋白368和473位，該病毒只發生L473V突變。在增加小鼠體內復制的PB1-F2蛋白中，該病毒表現為34個氨基酸的截短突變。在種屬特異性相關的PA蛋白100、356和409位，該病毒只發生S409N突變。在增加對小鼠致病性相關的M1蛋白30和215位，該病毒發生N30D和T215A突變。在M2蛋白耐藥位點上，該病毒未發生S31N耐藥突變，提示對金剛烷胺類藥物敏感。在增加對小鼠致病性相關的NS1蛋白42和205位點，該病毒發生P42S和N205S突變。

3 討 論

自1965年首次從美國火雞體內分離到H6亞型禽流感病毒以來[8]，該亞型病毒陸續在野禽和家禽體內分離到[9]。2013—2015年廣西活禽市場H6亞型禽流感病毒陽性率為5.93%，且呈逐年上升趨勢[10]。2016—2017年廈門市活禽市場低致病性禽流感病毒陽性率高達40.4%，主要為H9和H6亞型[11]。2002—2010年華東地區的監測數據顯示H3和H6亞型是主要流行的低致病性禽流感病毒亞型[12-14]。由于H6亞型禽流感病毒多為低致病性，對其研究也相對較少。2000年2月，低致病性H6N2亞型禽流感在美國加利福尼亞暴發，從散養的家禽和商品雞均可分離出禽流感病毒[15-16]。近年研究發現，H6亞型禽流感病毒可以感染人發生跨種間傳播，如2013年臺灣報道了首例人感染H6N1禽流感病毒病例[17]。血清學研究也顯示，早在2007年廣西健康人群中檢測到了H6亞型禽流感病毒抗體[18]。上述研究均提示H6亞型禽流感病毒具有突破種間屏障直接感染哺乳動物甚至感染人的潛能，這對公共衛生構成嚴重威脅。本研究對2018年分離于廣州禽類市場外環境中的1 株H6N2禽流感病毒進行全基因組測序，并進行了分子遺傳特征分析，這對持續監測H6亞型禽流感病毒的變異和預警有著重要意義。

表面基因分子特征分析顯示，該H6N2禽流感病毒優先結合禽源受體，裂解位點氨基酸序列也提示符合低致病性禽流感病毒分子特征，說明該病毒尚未發生較大變異，發生跨宿主傳播的風險較低。NA蛋白和M2蛋白耐藥位點顯示，該病毒對神經氨酸酶抑制劑和金剛烷胺類藥物敏感，與大部分禽源流感病毒的耐藥特點一致。NA蛋白未發生頸部氨基酸缺失，提示該病毒自然宿主可能源自于水禽，與H6亞型禽流感病毒易于感染鴨鵝等水禽[19]、不易感染雞的生物學特點相符。進一步對內部基因分子特征分析顯示，該病毒在PB2-89位、PB1-473位、PB1-F2蛋白、PA-409位、M1-30/215位、NS1-42/205位均發生對哺乳動物致病性增強的氨基酸變異，提示該毒株存在發生跨宿主傳播的潛在風險。

研究顯示，H6亞型禽流感病毒可以為人感染H5亞型禽流感病毒提供基因骨架，進而增加禽流感病毒跨物種傳播風險[18]，如1997年出現的人感染H5N1禽流感[20]、2014年和2015年先后在我國四川和廣東出現的人感染H5N6禽流感[21]。本研究中遺傳進化分析提示，該病毒NA基因來源于國內的H6N2禽流感病毒，未發現與H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H9N2等其他HxN2禽流感病毒重組的現象。全基因遺傳進化特征顯示，NP基因來源于HN573-like分支，其余基因均來源于ST339-like分支，表明該H6N2禽流感病毒為多分支進化來源的重組病毒，提示廣州市禽類市場外環境H6N2亞型禽流感病毒存在基因重組，但重組發生的時間和環節需要進一步的研究。

本研究率先對廣州地區禽類市場外環境H6N2亞型禽流感病毒進行全基因組遺傳特征分析，發現病毒存在基因重組現象，該病毒雖為禽源低致病性病毒，但存在發生跨宿主傳播的潛在風險，應持續加強對H6N2亞型禽流感病毒的流行和變異監測。

利益沖突：無