IL-17a通過STAT3信號通路調節HaCaT細胞中IL-6、IL-22、IL-23的表達

劉瑞真 吳小末

【關鍵詞】 IL-17a HaCaT細胞 IL-6 IL-22 IL-23 STAT3

[Abstract] Objective： To explore the effect of interleukin-17a （IL-17a） on the expression of IL-6， IL-22， IL-23 in human immortalized keratinocytes （HaCaT） cells and possible mechamism of IL-17a regulating IL-6， IL-22， IL-23 in keratinocytes. Method： HaCaT cells were divided into blank control group （DMEM high-glucose medium only）， induction group （DMEM high-glucose medium containing 80 μg/L IL-17a） and inhibitor group （DMEM high-glucose medium containing 80 μg/L IL-17a and 10 μg/L STAT3 inhibitor Piceatannol）. After 48 h， we examined the expression of IL-6， IL-22， IL-23 by double antibody sandwich enzyme-1inked immunosorbent assay （ELISA） in the cells supernatant and realtime polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， IL-22， IL-23 in HaCaT cell of all group. Protein expression of STAT3 was detected by Western Blot. Result： Compared with blank control group and inhibitor group， the expression levels and mRNA of IL-6， IL-22 and IL-23 in HaCaT cells in induction group were significantly increased （P<0.05）. Compared with the blank control group and the inhibitor group， the expression level of STAT3 protein in HaCaT cells in the induction group was significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Il-17a can promote the secretion of IL-6， IL-22 and IL-23 by HaCaT cells， which may be regulated by STAT3.

[Key words] IL-17a HaCaT cells IL-6 IL-22 IL-23 STAT3

First-author’s address： Dermatology Hospita of Fuzhou， Fuzhou 350000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.004

銀屑病是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，全球發病率為2%～3%[1]。近年來該病發病率逐漸上升，其發病機制一直是皮膚科的研究熱點，該病一度被認為是由TNF介導的Th1型免疫應答相關的疾病。隨著第3種輔助性T細胞（T helper 17 cell，Th17）的發現，傳統的銀屑病免疫學發病機制受到了很大的挑戰[2]。Th17是一種新發現的CD4+效應T細胞，分泌IL-17a、IL-17F、IL-22等，而其中IL-17a被認為是銀屑病生理發病機制的關鍵[3-4]，IL-17a具有誘導趨化、抑制中性粒細胞凋亡、促進新生血管形成、促進活化的角質形成細胞產生更多趨化因子、促進其他細胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）生成等作用[5]。以往研究發現銀屑病患者外周血及其皮損處IL-6、IL-17、IL-22、IL-23表達水平明顯增高[6-7]。關于銀屑病發病機制信號通路的研究發現，信號傳導和轉錄激活因子3（signal-transducer and activator of transeription-3，STAT3）在銀屑病患者皮損處角質形成細胞中的表達也是升高的，該細胞因子與信號傳導和轉錄因子被證實與細胞的增殖分化及凋亡關系密切，與銀屑病角質細胞的過度增生可能有著一定的聯系。有研究發現IL-17a可激活STAT3，進而激活細胞增殖的細胞內信號通路，在銀屑病角質形成細胞增殖中發揮重要作用[8]。本研究通過建立IL-17a誘導HaCaT細胞增殖模型，探討IL-17a調控角質形成細胞中IL-6、IL-22、IL-23表達的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞。HaCaT細胞株（人永生化表皮細胞）購于ATCC。（2）主要藥物和試劑。IL-17a抗體購于abcam IL-6 ELISA試劑盒、IL-22 ELISA試劑盒、IL-23 ELISA試劑盒購于abcam;STAT3抑制劑（白皮衫醇）購于MCE;DMEM培養液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自美國Gibco公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（50T）購于北京索來寶科技有限公司;STAT3WB抗體購于abcam公司。（3）主要儀器。CO2恒溫培養箱、超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、冷凍高速離心機，QPCR儀，酶標儀，80 ℃低溫冰箱、-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱，電泳系統及電泳槽，凝膠成像系統。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HaCaT細胞使用高糖DMEM培養基（內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），培養條件為5%CO2、37 ℃恒溫培養箱，飽和濕度95%。以5×106個/mL HaCaT細胞鋪于6孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養24 h。待其細胞達到70%～80%融合度時開始分組。

1.2.2 細胞分組與處理 空白對照組（DMEM高糖培養基）、誘導組（含80 μg/L IL-17a的DMEM高糖培養基）、抑制劑組（含80 μg/L IL-17a的DMEM高糖培養基和10 μmol/L白皮衫醇），每組設置3個復孔，細胞重復培養6次，刺激48 h后分別收集上清和細胞。

1.2.3 ELISA法檢測細胞分泌炎癥因子IL-6、IL-22、IL-23 收集上述不同分組的細胞培養上清液，應用ELISA法檢測IL-6、IL-22、IL-23濃度，按試劑盒說明書進行操作，每個樣本和標準品均設3個復孔，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（A）值，根據標準曲線計算出樣品濃度。

1.2.4 Real-time PCR法檢測細胞因子IL-6、IL-22、IL-23 mRNA的表達 Trizol法提取細胞總RNA，使用逆轉錄酶進行逆轉錄，得到相應cDNA，以β-actin為參照，用Ultra SYBR Mixture進行擴增，檢測細胞因子IL-6、IL-22、IL-23的mRNA表達。引物見表1。反應條件：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，45個循環。實驗結果以Ct值反映基因mRNA含量，采用2-ΔΔCt對數據進行相對定量分析。

1.2.5 Western Blot法檢測各組細胞STAT3表達水平 48 h后收集細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取10 μg蛋白樣本，經SDS-PAGE后，轉膜，用5%牛血清白蛋白封閉，封閉完將NC膜放入裝有一抗（β-actin，STAT3）的抗體雜交盒中，搖床4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗滌孵育好的NC膜，洗3次，10 min/次。清洗完畢后，將NC膜放入

1︰5 000稀釋的鼠二抗雜交盒中，水平搖床上室溫孵育2 h;將NC膜平置于透明膜上，Thermo ECL試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面，暗處靜置3 min后去除膜上發光液，置于透明膜上。采用凝膠成像系統Versa DocTM imaging system發光檢測，收集條帶圖像。用凝膠成像系統分析條帶灰度值，確定樣品中目的蛋白表達的相對含量。

1.3 觀察指標 比較各組HaCaT細胞IL-6、IL-22、IL-23表達水平;比較各組HaCaT細胞IL-6、IL-22、IL-23 mRNA結果;比較各組HaCaT細胞STAT3蛋白表達情況。

1.4 統計學處理 用SPSS 22.0統計軟件進行分析，實驗數據均采用（x±s）表示，方差齊性用單因素方差分析（one-way ANOVE），多組間兩兩比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HaCaT細胞IL-6、IL-22、IL-23表達水平比較 空白對照組、誘導組和抑制劑組HaCaT細胞IL-6、IL-22、IL-23表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;與空白對照組和抑制劑組比較，誘導組的HaCaT細胞IL-6、IL-22、IL-23表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P空白對照組=0.028 0、0.042 9、0.014 6，P抑制劑組=0.030 6、0.041 3、0.031 3）。見圖1～3和表2。

0.012 8、0.043 9、0.019 8，P抑制劑組=0.037 7、0.045 6、0.046 8）。見圖4和表3。

3 討論

IL-17a是一個促炎癥細胞因子，銀屑病患者皮損處角質形成細胞IL-17a的表達水平明顯升高，提示IL-17a在銀屑病的發病中起著至關重要的作用[9]。STAT3是一種重要的轉錄因子，與腫瘤、自身免疫性疾病等相關，通過參與Th17細胞分化、角質形成細胞過度增生與異常分化、與炎癥細胞相互作用、真皮血管增生等重要病理過程在銀屑病發病中起關鍵作用[10-11]。有研究發現，IL-17可通過激活JAK2/STAT3信號通路促進角質形成細胞VEGF的表達，提示STAT3可能介導IL-17誘導角質細胞的增殖[12]。通過研究筆者發現IL-17a可以促進HaCaT細胞分泌IL-6、IL-22、IL-23。其中IL-6與表皮、真皮細胞的生長、分化有關，可引起自身抗原體呈異常而觸發自身免疫反應，可直接刺激T細胞向表皮遷移、促進角質形成細胞和T細胞增殖和活化，且和銀屑病的嚴重程度相關[13];IL-22是一種具有免疫調節作用的炎癥性因子，主要由活化的Th22細胞、Th17細胞以及NK細胞分泌產生[14]。有研究發現IL-22在銀屑病患者皮損和外周血的表達異常升高，通過調節角質形成細胞的增殖和分化從而促進銀屑病的發生發展[15]，此外IL-22與銀屑病患者的病情嚴重程度有關，不同分期患者的PASI評分與血清IL-22呈正相關[16]。IL-23是銀屑病發病過程中IL-17和IL-23/Th17軸的一個不可或缺的細胞因子。IL-23不僅可以誘導角質形成細胞增殖，還促進新生血管生成并募集中性粒細胞與巨噬細胞等[17]，還可促進Th17細胞的分化、活化，加強Th17細胞誘發免疫紊亂和維持其功能是[18]。通過研究筆者還發現IL-17a刺激HaCaT細胞分泌IL-6、IL-22、IL-23的這一過程，可通過抑制STAT3的表達而被抑制，提示STAT3在IL-17a促進銀屑病發生發展過程中的重要作用，通過阻斷STAT3的表達，可以使IL-17a促角質形成細胞分泌炎癥性細胞因子的能力下降，從而減緩角質細胞的增殖速度同時減輕局部的炎癥反應[19]，進而減緩疾病的進展。

盡管目前IL-17、IL-23抗體在銀屑病治療中取得了非常顯著的成效[20]，但作用于STAT3及其上游通路的相關因子如JAK1/2，也是目前一個治療靶點，其口服及外用藥物的劑型，以及其較低的經濟成本、較少誘導的不良免疫反應，為其在臨床中的應用起到了一個很好的鋪墊，本研究進一步驗證了STAT3在銀屑病發病過程中起的重要作用，為今后開展銀屑病新的靶向治療提供理論依據。

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（收稿日期：2021-08-10） （本文編輯：張爽）