秸稈還田對半干旱區玉米農田土壤細菌群落結構的影響

孫孟琪，劉浩然，劉小丹，王洪君，王 楠，高 陽，欒天浩，王立春，陳寶玉

(1.吉林省農業科學院農業資源與環境研究所，農業農村部東北植物營養與農業環境重點實驗室，吉林 長春 130033；2.吉林農業大學資源與環境學院，吉林 長春 130118；3.白城市農業機械化技術推廣站，吉林 白城 137000)

土壤微生物是農田生態系統的重要組成部分，在土壤有機質形成和轉化、土壤養分循環等方面發揮著至關重要的作用[1].同時，土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質量和肥力的一個關鍵性指標[2]，而細菌作為土壤微生物中的重要類群，其多樣性以及群落結構的變化更能夠反映土壤的質量狀況[3].農田生態系統在耕作措施和有機物料的輸入改變土壤理化性質的同時，對土壤微生物多樣性及群落結構也產生了不同的影響[4].研究不同秸稈還田方式下土壤微生物多樣性及群落結構演替規律，對選擇合理的種植措施和改善土壤生態功能具有重要意義.

淡黑鈣土為吉林省西部的主要土壤類型，其主要特征為腐殖質積累過程弱、含量低，因此其肥力效果相對較差[5].作為少數可受人為調控的農田土壤培肥方式，秸稈還田越發受到重視.目前，秸稈還田也是該區域提升地力的有效手段之一，是土壤有機碳和養分的重要來源[6].大量研究表明，玉米秸稈還田可有效改善土壤有機質下降以及養分過量消耗等問題，有助于提升土壤肥力、增加作物產量[7-8].特別是作物秸稈還田后，可供微生物生命活動的有機物顯著增加，促進了土壤微生物(真菌、細菌等)的代謝繁殖.陸思旭等[9]研究發現，渭北地區旱地農田土壤有機碳是影響微生物碳源代謝的主要因素，而免耕、深松、隔年輪耕為該區域適宜的耕作措施.李景等[10]對豫西保護性耕作土壤的研究發現，免耕、深松覆蓋可改善土壤團聚體的狀況，提高土壤微生物的多樣性指數.但針對吉林省西部半干旱區耕作措施對玉米農田土壤微生態系統的影響尚缺乏認識，土壤微生物與生態環境間的響應機制仍需探討.

本研究針對不同玉米秸稈還田方式下，玉米農田土壤化學性質及酶活性變化特征，利用Illumina Miseq高通量測序技術，揭示了土壤微生物多樣性、群落結構分布規律及其與關鍵環境因子間的關系，為進一步探明土壤微生物對不同秸稈還田方式的響應機制以及建立適宜該區域的耕作制度提供了理論支撐與參考依據.

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

大田試驗的地點位于吉林省白城市洮北區青山鎮生產村(N45°69′，E122°86′).研究區屬溫帶大陸性季風氣候，年平均降水量為399.9 mm，年平均氣溫5.2℃，≥10℃活動積溫平均為2 996.2℃，無霜期平均為144 d，年平均日照時數為2 915 h.土壤類型為淡黑鈣土，基礎理化性質為：土壤全氮含量1.04 g/kg，土壤全磷含量0.31 g/kg，土壤全鉀含量24.79 g/kg，土壤有機質含量20.00 g/kg，pH=6.40.

1.2 試驗設計

試驗布設從2018年開始，連續耕作兩年.試驗采用秸稈全量還田方式，共設置4個處理：傳統耕作(NT，秸稈不還田+常規種植，作為對照CK)；覆蓋+秸稈還田(CS)；旋耕+秸稈還田(RS)；旋耕-覆蓋(CRS，第一年覆蓋+第二年旋耕)輪耕處理.采用小區試驗，設3次重復.每年各處理均于4月末播種，9月末收獲，常規田間管理.種植品種為翔玉998，播種密度70 000株/hm2，播種前施用復合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=28∶12∶14)作為基肥.

1.3 樣本采集與處理

為了評價連續兩個耕作季之后的土壤狀況，于2019年9月下旬玉米收獲后，在各處理樣地內隨機取樣.每個處理設5個土壤采樣點，去除土壤表層植株，采集0～20 cm土壤樣品，用無菌袋收集.將每個處理所有樣品除去土壤中的根系、碎石及其他雜物，充分混勻后分成3份用于微生物多樣性研究.土壤樣本在凍存狀態下寄送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序.用于土壤酶活測定的樣品4℃保存，風干樣品用于測定土壤理化性質.

1.4 土壤化學性質及酶活性指標測定

土壤pH值及養分(有機質、全氮、全磷、全鉀、有效氮、速效磷以及速效鉀)含量采用常規方法進行測定.土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進行測定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法進行測定[11-12].

1.5 PCR擴增及測序

利用 E.Z.N.A.? soil DNA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)土壤試劑盒對供試樣品進行土壤微生物總 DNA 的提取，采用細菌16S rRNA擴增引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) V3-V4高變區進行PCR擴增，進一步純化后進行雙端測序.PCR 反應條件為：95℃初變性3 min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 min，72℃ 45 s，35個循環；72℃延伸 10 min；4℃保溫.采用Illumina MiSeq PE300平臺(San Diego，CA，USA)進行測序.原始測序序列使用Trimmlmatic軟件進行質控，使用FLASH軟件進行拼接后去除質控后長度低于50 bp的序列；去除模糊堿基；根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接.使用Uparse v7.1 (version 7.1 http：∥drive5.com/uparse/)軟件[13]對有效數據在97%相似度水平的OTU代表序列進行聚類分析；使用UCHIME軟件剔除嵌合體.基于Silva (SSU123) 16S rRNA數據庫，采用RDP分類算法(http：∥rdp.cme.msu.edu/)對每個16S rRNA基因序列進行分類分析，置信閾值為70%.根據測序結果分析各個水平上統計樣品的群落結構.

1.6 數據處理

土壤化學性質及酶活性數據利用DPS及Microsoft Excel 2017軟件進行完全隨機分析.測序數據利用Mothur軟件[14]對序列進行抽平，并計算Shannon，Simpson多樣性指數和Chao1豐富度指數.利用R(v.4.0.3)軟件(R Development CoreTeam，2006) 對不同耕作條件下細菌群落結構組成的變化特征和其主要驅動因子進行熱圖(heatmap)、非度量多維尺度和聚類分析.

2 結果與分析

2.1 不同處理土壤化學性質的比較

不同處理土壤化學性質的結果見表1.由表1可見，與CK相比各處理土壤養分含量均存在差異.各處理pH均為中性，且變化并不顯著，其中RS處理土壤pH最低、CRS則最高.從水解性氮含量來看，CS處理模式為最高，較CK提升了38.47%，而RS和CRS處理較CK分別提升了15.39%和7.70%.CS模式顯著提升了土壤有機質含量，較CK提升32.08%，而CRS處理卻降低了12.5%.綜合分析結果，不同秸稈還田處理中，CS處理對土壤全氮/磷/鉀、速效鉀、有效氮及有機質含量均具有明顯的提升作用；CRS處理模式則不同程度降低了相關指標.

表1 不同還田方式下土壤化學性質

已有的研究表明，秸稈以不同方式還于土壤(覆蓋、旋混)，使其被微生物分解的機會大大增加，可促進土壤養分積累；秸稈在腐解的過程中，也會激活土壤中氮、磷和鉀等養分，進而提高速效性養分[15-17].本研究中，旋混還田和免耕覆蓋還田方式不但有效增加了土壤有機碳含量，還改善了土壤pH，有利于植物生長；對比不同處理方式，免耕覆蓋秸稈還田模式對土壤養分總體提升更為顯著.

2.2 不同處理對土壤酶活性的影響

由表2可見，不同耕作措施結合秸稈還田后，均不同程度地改變了土壤的活性.在土壤蔗糖酶活性方面，CK處理為最高，其次為CS處理，CRS處理為最低；CS處理較CK略有降低，但未達到顯著水平.土壤脲酶活性則為CS處理最高，較CK處理提升了29.28%，RS次之；CRS處理活性最低，較CK降低5.88%.土壤酸性磷酸酶活性分析結果顯示，RS>CS>CK>CRS；RS處理較CK活性提升了31.33%，CS提升了20.62%.對比3種方式，CS、RS兩個處理均能夠顯著提高土壤脲酶酸性磷酸酶活性，輪耕模式(CRS)則極顯著降低了蔗糖酶活性，同時脲酶和酸性磷酸酶活性也大大下降.

表2 不同處理土壤酶活性 U/g

土壤酶活性與土壤化學性質、養分含量和耕作方式有著緊密的聯系，也是評價土壤肥力的關鍵因素[18-20].秸稈還田后，可以增加土壤氮和碳的供應，從而導致脲酶和蔗糖酶活性均相應改變.本研究中，不同秸稈還田方式下，免耕覆蓋還田和旋混還田均顯著提高了土壤蔗糖酶及脲酶活性，這主要是由于外源有機碳(秸稈)的添加，帶來了新的養分，通過微生物作用固存到土壤中.而輪耕模式則使酶活均呈下降趨勢，這主要是由于耕作方式的改變，導致土壤物理性狀發生改變，進一步改變了土壤水、熱、氣的綜合作用效果，使整體酶活性較常規種植降低.

2.3 不同處理對微生物多樣性的影響

通過16SrRNA基因高通量測序，在97%相似度下降序列聚類分析物種分類單元(OTU)，統計各OTU在不同樣品中的豐度信息并進行α-多樣性分析[21-23]，結果見表3.其中：Sobs指數是指實際觀測到的OTU數目；Shannon指數和Simpson指數主要用來衡量物種的多樣性情況；Chao1指數主要用來衡量物種的豐富度；Coverage指數主要用來檢測測序對物種的覆蓋度.根據多樣性指數可以看出，所有樣品的覆蓋度均在95%以上，說明取樣合理，所測結果有效可靠，可真實反映不同處理條件下土壤中的細菌群落組成[24-25].由表3可以看出，Shannon以及Chao1指數為CK>CRS>RS>CS，說明秸稈還田下的3種耕作方式(CS、RS、CRS)土壤群落物種多樣性均略低于常規種植(CK)方式.而Simpson指數在4種耕作條件下變化較低，說明秸稈還田耕作方式對細菌的均勻性起到的作用有限.通過秸稈還田結合免耕覆蓋、旋混旋耕等耕作措施，土壤的Shannon和Chao1指數均低于傳統耕作，而Simpson指數變化有限.這個結果側面說明本研究所設3種耕作措施可在一定程度上富集可分解秸稈的特定微生物種群，導致整體微生物群落發生改變.

表3 不同處理土壤細菌多樣性指數

2.4 不同秸稈還田方式對土壤細菌群落的影響

2.3.1 土壤細菌綱水平上的比較

各處理土壤細菌群落在綱水平上占主要數量的優勢物種基本相同，前4位綱分別為Alphaproteobacteria(15.84%～20.64%)，Actinobacteria(11.15%～14.95%)，Gammaproteobacteria(12.39%～14.09%)以及Blastocatellia Subgroup_4(8.26%～12.24%) (見圖1).與CK(NT)比較發現，在綱水平上，所占比率較低的Bacteroidia(CK 4.70%，其他5.30%±0.35%)、Saccharimonadia(CK 1.16%，其他2.71%±1.18%)、Verrucomicrobiae(CK 2.08%，其他2.56%±0.33%)占比一致增加，而Holophagae (CK 1.18%，其他0.56%±0.11%)占比一致減少，說明耕作措施以及秸稈還田對土壤細菌群落在綱水平上有一定影響.Holophagae在CK中所占比率分別高于RS 2.84倍和CRS 2.04倍，Acidobacteriia在CK中所占比率分別低于RS 0.59倍和CRS 0.52倍，說明這兩種綱受到旋混耕作措施的影響顯著.然而，Saccharimonadia在CS和RS中所占比率分別低于CK處理0.44倍和0.28倍，說明Saccharimonadia對不同秸稈還田方式的響應更為顯著.

圖1 不同處理樣本綱水平細菌群落組成

2.3.2 土壤細菌科水平上的比較

在科分類水平上，共檢測到土壤細菌362科，其中，CK有324科，CS有309 科，RS和CRS有302科.進一步對任意一個樣品豐度高于1.0%的物種在科水平進行熱圖(heatmap)分析，結果(見圖2)表明，前3種豐度最高的科為Pyrinomonadaceae(CK 9.38%，CS 8.73%，RS 5.72%，CRS 7.88%)，Sphingomonadaceae(CK 8.04%，CS 7.24%，RS 9.76%，CRS 7.54%)以及Acidobacteria Subgroup_6(CK 7.69%，CS 9.33%，RS 5.22%，CRS 6.30%)，在不同處理的土壤細菌群落所占比率為20.69%～25.31%.與CK比較，Pyrinomonadaceae，Burkholderiaceae，Holophagae Subgroup_7，Actinobacteria IMCC26256，Xanthomonadaceae等5科通過秸稈覆蓋還田、旋混還田等處理措施之后豐度一致減少，而Solibacteraceae，Blastocatellaceae，Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Pedosphaeraceae，Rhizobiaceae，Micropepsaceae豐度一致增加.此外，與CK相比較，Acidobacteria Subgroup_6和Xanthobacteraceae僅在旋混還田處理中分別增加了32%和30%，而Rokubacteriales減少了51%.這些結果說明本研究中所設的3種不同秸稈還田結合耕作措施處理顯著改變了土壤細菌的群落結構.

圖2 不同處理樣本科水平豐度前30的群落熱圖(heatmap)

已有研究表明，Rhodanobacteraceae細菌可以利用不同的碳基作為碳源，而Saccharimonadales細菌可促進植物自身及其衍生有機物的降解.此外，Blastocatellaceae細菌與聚合物的碳代謝有關.由于秸稈還田可直接增加各處理土壤的有機物含量，而這些有機物可被微生物降解，進而使有機質及養分等物質在秸稈還田的土壤中較常規種植土壤增加.

2.4 細菌群落結構變化與環境因子的關系

基于各OTU的Bray-curtis聚類圖譜分析(見圖3)表明，在OTU水平上4種不同耕作處理間細菌群落結構差異顯著(最大差異為30%).與常規耕作比較，OTU水平上群落結構變化為CRS>RS>CS，說明土壤中細菌群落結構受到耕作措施的影響較大.

圖3 不同處理樣本細菌群落聚類分析

利用非度量多維尺度分析和聚類 (NMDS)結合環境因子進行的相關性分析(見圖4)發現，土壤中pH、速鉀、全氮、有機質含量以及土壤脲酶是細菌群落結構發生變化的主要驅動因子(P<0.01)，其中，土壤中有機質和全氮含量對細菌群落結構變化貢獻度最大.

3 結論

本研究針對吉林省西部半干旱區典型淡黑鈣土地區農田土壤，采用高通量測序方法，對不同耕作措施結合秸稈還田后土壤養分變化、土壤酶活性、微生物多樣性及群落結構特征進行了研究，結果表明：(1)秸稈覆蓋還田與旋混還田均可提高土壤中氮、磷、鉀以及有機質含量并降低土壤pH；(2)秸稈覆蓋還田與旋混還田均能夠有效地富集 Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Solibacteraceae，Blastocatellaceae細菌；(3)pH、速鉀、全氮、有機質含量以及土壤脲酶活性是細菌群落結構發生變化的主要驅動因子(P<0.01).以上研究為進一步探明土壤微生態對秸稈還田的響應機制，以及建立適宜吉林省西部半干旱區農田的秸稈還田模式提供了理論支撐與科學依據.