牛黃及其代用品摻雜偽品的鑒別

杜 娟

牛黃源于牛科動物牛的膽管或膽囊中的結石，是一種病理產物[1]。天然牛黃稀少而價格較高，針對這一現狀，我國科研工作者研制出牛黃代用品：人工牛黃、體內培植牛黃、體外培育牛黃等，并已收錄于2015年版《中華人民共和國藥典》[1]。牛黃代用品價格相對低廉，可以更大程度上滿足日漸增高的市場需求。但牛黃藥材市場中時常發生牛黃代用品摻偽問題，此種情況嚴重降低牛黃的質量，直接影響臨床用藥的安全性與有效性[2]。(牛黃Bovis Calculus、牛Bos taurus domesticus Gemlin)

1 牛黃及代用品種類

1.1 天然牛黃現代醫學研究認為天然牛黃是因為肝膽疾患引起的。其主要成分有膽色素類、膽汁酸(包括游離型和結合型膽汁酸)、脂肪酸、膽固醇、氨基酸、卵磷脂等。天然牛黃在我國按照產地不同可分為東牛黃、西黃、蘇牛黃、京牛黃，其中京牛黃和蘇牛黃多為膽紅素-膽固醇結石，東牛黃多為膽紅素結石。

1.2 人工牛黃依照天然牛黃的主要成分表，將膽紅素、牛磺酸、豬去氧膽酸、牛膽粉、膽固醇、磷酸三鈣、硫酸鎂等與淀粉混合，制成人工牛黃。

1.3 體內培植牛黃20世紀70年代我國成功研制出體內培植牛黃。經外科手術的方式，將致黃因子(特定異物)植入活牛膽中，并注射一種菌液，能促進牛黃的產生。主要由膽紅素鈣、膽汁酸類、蛋白質、氨基酸以及微量元素等組成。因與天然牛黃的形成環境大體相同，有研究指出二者含有成分、理化性質和藥理作用等無明顯差異。但由于遭受醫學倫理質疑，且周期長、成本高，未能在市場上廣泛流通，也未被《中華人民共和國藥典》收錄。

1.4 體外培育牛黃20世紀70年代我國因生物工程技術快速發展，成功研制出體外培育牛黃，模擬體內天然牛黃形成的原理和環境，通過物理生化方法使牛膽汁生成牛膽紅素鈣結石[3]。其化學成分、理化性質及藥理作用與天然牛黃大體相似。

2 牛黃及其代用品的鑒別

2.1 性狀鑒別天然牛黃的物理性狀特點是表面鮮棕黃色、質地松脆、蛋黃完整、斷面紋路細膩清晰。人工培植牛黃是通過外科手術的方法在活體牛的膽囊內留置致黃因子，進而生成牛黃。人工培植牛黃質地松而輕，呈土黃色，為疏松的粉末，味苦微甜，入口后無清涼感，氣略腥而微清香。天然牛黃與人工牛黃的性味、色澤、理化特性、藥效成分之間無明顯差異[4]。人工牛黃是牛膽汁酸、膽紅素與無機鹽(硫酸鎂、硫酸亞鐵和磷酸三鈣)、膽固醇、淀粉等原料混合而成。人工牛黃顯金黃色或淺棕黃色，質輕，大多為疏松粉末，也有因制法不同而呈方形或球形，水溶后可染指甲為黃色，味苦而微甜，入口后無清涼，感氣略腥而微清香[5]。

2.2 薄層鑒別相關研究指出[6]，牛黃中含量最高的是膽紅素，其次為膽汁酸、膽酸、去氧膽酸、膽汁酸鹽、膽固醇等，還含有微量元素、類肽的平滑肌收縮成分、胡蘿卜素類物質、氨基酸。人工培植牛黃與天然牛黃在膽汁酸、膽酸的含量有差異[7]。葉蓓蓓[8]以膽酸提取樣品，使用薄層掃描法測定了膽汁酸的含量，與天然牛黃進行區分。還有研究者認為牛黃質量控制的最佳方法是利用薄層掃描儀對不同濃度的膽酸薄層指紋圖譜進行掃描，并測定膽酸的含量，得出膽酸的指紋特征圖譜。薄層色譜建立的指紋特征圖譜能準確、快速地進行含量測定，可用于人工牛黃中膽酸的定量分析研究。薄層鑒別方法操作簡單，但是鑒別準確度不高。

2.3 重氮化比色法和水性溶劑法由于形成環境、培育方法等因素的不同，天然牛黃與人工培育牛黃在膽紅素的含量上可能有差異。膽紅素的傳統測定方法有水性溶劑法和重氮化比色法。重氮化比色法測定膽紅素含量是在520 nm波長處測定膽紅素與重氮化試劑發生偶聯反應生成的偶氮染料的吸光度。水性溶劑法通過添加反應促進劑測膽紅素的溶解度，以得到更加準確的膽紅素含量測定值[9]。

2.4 高效液相色譜法高效液相色譜法具有準確度與重現性較高的特點，能較好地控制牛黃及其代用品的質量。夏晶等[10]使用高效液相-紫外吸收法比對天然牛黃和體外培育牛黃中膽紅素的含量，發現體外培育牛黃中沒有游離膽紅素而天然牛黃中有少量游離膽紅素；體外培育牛黃中結合膽紅素的含量較高而牛黃中以共價膽紅素為主，以此可明顯鑒別牛黃及其代用品。但是高效液相-紫外吸收法操作比較繁瑣，影響因素較多，鑒別準確度不高。與高效液相-紫外吸收法不同，高效液相-蒸發光散射法是一種質量型通用檢測器，對牛黃中無紫外吸收的膽汁酸分析檢測顯示出了極大的優越性。李珂等[11]對10批天然牛黃和10批體外培育牛黃使用高效液相-蒸發光散射法測定膽固醇含量，并進行比對，發現可能因產地、來源等不同，牛黃與體外培育牛黃中膽固醇的含量有差異，且體外培育牛黃因制備工藝穩定其膽固醇含量差異較小。牛黃中膽汁酸種類復雜，且一部分膽汁酸含量很低，不容易檢測得到，高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)選擇性和靈敏度高，可以較好地分離牛黃中的膽汁酸成分。雷凱等[12]通過三重四極桿質譜檢測器法測定牛黃及代用品中的多種膽汁酸和膽紅素成分的含量，發現培育牛黃和牛黃中結合型膽汁酸的含量比例存在明顯差異，且豬去氧膽酸是人工牛黃獨特的成分。

2.5 近紅外光譜法近紅外光譜能夠反映樣品中化學成分的全貌，研究對象的分類通過結合模式識別技術實現。目前已經有一些研究將近紅外光譜法應用于牛黃及其代用品的鑒別上。陽志云等[13]的人工牛黃的真偽鑒別模型是基于歐氏距離建立。艾莉等[14]運用聚類分析分別分析人工牛黃的正品與偽品，發現正品與偽品牛黃各聚為一類，2類之間的界限明顯。偽品人工牛黃可通過近紅外光譜分析技術進行鑒別，與理化方法鑒別結果一致，并且具有無損、快速、準確的優點。牛黃及其偽品的近紅外光譜原始吸收模式相似,吸收峰位置和相對強度不同是其主要差別。不同種類牛黃樣品的化學組成可以通過近紅外光譜進行反映。光譜的相似性導致天然牛黃的鑒別必須依靠化學模式識別方法在光譜數據中提取相關化學信息才能實現。徐璐等[15]將基于偏小二乘回歸的類模型方法應用于天然牛黃、人工牛黃摻偽品的鑒別分類上，準確度高達100%。聶黎行等[16]比較天然牛黃、人工牛黃和體外培育牛黃的近紅外漫反射光譜差異，利用主成分分析法觀察不同樣品主成分空間分布，結果發現其主成分空間分布明顯不同，天然牛黃、體外培育牛黃和人工牛黃各自單獨聚為一類，預測準確率高達100%。近紅外光譜技術無樣品破壞，無人為主觀因素的影響，無環境污染，不消耗化學試劑，牛黃等貴細中藥的分析與鑒別尤其適用。而傳統感官指標數字化、準確、快速、簡便、客觀等是引入模式識別技術的優點。

2.6 氨基酸自動分析儀法張啟明等[17]測定并分析牛黃及代用品中含有的氨基酸，發現培植牛黃中的氨基酸總量明顯多于天然牛黃(天然牛黃中游離氨基酸只有萬分之幾至千分之幾)。

3 小結與展望

牛黃及其代用品化學成分復雜，經過查閱與總結文獻，人工牛黃中含有豬去氧膽酸和少量游離膽紅素，這點與天然牛黃、體外培育牛黃、體內培育牛黃相區別。牛黃中結合膽紅素比例明顯偏低，牛黃中的共價膽紅素顯著高于體外培育牛黃，而且體外培育牛黃不含有游離膽紅素，鑒別牛黃及其代用品可通過不同類型的膽紅素含量比例進行。因藥材市場上牛黃摻偽技術逐步增強，僅僅測定膽汁酸、膽紅素等成分的含量差異不能準確鑒別與區分在牛黃正品中摻入其他代用品。找到牛黃和體外培育牛黃各自的專屬性意義特征成分，隨之建立專屬性檢測，能使牛黃類中藥材成藥摻偽造假問題得到有效解決。目前這類多指標檢測、指紋圖譜檢測研究相對較少，亟待研究者進一步深入探討。