免疫評分系統在結腸癌中的應用研究進展*

龔惠英，周 睿，張 濤 綜述，李龍浩 審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院腫瘤科，重慶 400016)

結直腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，居男性第3位、女性第2位[1]。其中結腸癌每年新增120多萬病例，死亡人數達60多萬，是導致癌癥死亡的第5大惡性腫瘤[2]。目前,結腸癌常用的分期系統是美國癌癥聯合委員會/國際抗癌聯盟的TNM分期。越來越多的臨床資料顯示，同一類型腫瘤相同分期的不同患者經過相同或類似治療后，其臨床結局有顯著差異[3]，這表明該分期在提供預后信息方面存在局限性。隨后又提出了多種預后評估方法，包括根據腫瘤形態學、信號通路、基因表達狀態等評估患者預后[4-5]。其中，根據基因表達狀態、mirRNA等建立了多種數學預測模型，如Oncotype DX、ColoPrint評分系統等。這些模型具有較高的預后價值，但是由于其技術的成熟性、可及性、經濟性等原因未能廣泛應用于臨床。目前，臨床醫生通常綜合TNM分期、腫瘤位置、基因表達和錯配修復功能狀態等評估患者預后。隨著對腫瘤微環境的深入研究發現，腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在抗腫瘤治療方面具有重要作用[6-7]。因此，有學者提出采用免疫評分系統評估腫瘤患者的預后情況。有研究表明，該系統的預后預測能力優于TNM分期，可進一步指導腫瘤患者治療決策的制定。本文對免疫評分系統進行了系統綜述，以期為腫瘤預后評估的選擇提供一些思路。

1 癌癥定義的演變

20世紀基于對基因組的認識，癌癥被定義為參與細胞分裂、增殖的基因發生累積突變而引起的疾病。這一觀點以癌細胞為中心，即無論其所處何種環境，只要其基因組發生突變都可導致該細胞發生不可逆的變化。有學者提出通過導入外源性正?；騺碇委煱┌Y[8]。這為癌癥的診斷、治療提供了新策略，但其認識仍存在局限性。2000年，HANAHAN和WEINBERG發現了癌癥的六大基本特征，即生長信號自給自足、對生長抑制信號不敏感、逃避細胞凋亡、無限復制潛能、持續血管生成、組織侵襲和轉移。2011年又補充了4個特征：調控能量代謝、逃避免疫監視、促進腫瘤炎癥、基因組不穩定和突變[9]。這一發現讓人們對癌癥有了更加全面的認識。癌癥不再僅由癌細胞定義，而以癌細胞及其微環境共同定義[3]。其中，腫瘤微環境由成纖維細胞、免疫細胞、炎細胞及其生物分子等組成，這些細胞通過直接接觸或分泌細胞因子等方式影響癌癥進展。研究表明，腫瘤預后與其微環境中免疫成分密切相關(主要指免疫細胞的密度、類型、分布區域和表型激活狀態)，其中TIL密度與患者生存期呈正相關[10-12]。

2 免疫評分系統的發展

有研究通過高通量結腸癌微環境數據庫分析發現，CD3、CD8、顆粒酶B(GZMB)等免疫相關基因與患者生存期密切相關，且在其組織切片中發現腫瘤中心和腫瘤浸潤邊緣(IM)CD3+、CD8+、CD45R0+、GZMB+細胞浸潤密度與患者生存期呈正相關[13]。與單純腫瘤區域腫瘤中心或IM相比，腫瘤中心和IM的聯合分析明顯提高了其預后準確性?；谝陨习l現，GALON等建立了免疫評分系統以評估腫瘤患者的臨床預后情況。由于腫瘤內CD45R0+與CD3+T細胞浸潤密度高度相似，且在制片和染色過程中CD45R0和GZMB抗原性易迅速丟失，最終將腫瘤中心和IM中CD3+、CD8+T細胞浸潤密度作為評分依據。其具體方法是先從每個腫瘤組織樣本取得2個同時包含腫瘤中心和IM的切片，分別進行CD3、CD8單抗染色；再利用免疫評分病理圖像分析儀(將專門研發的免疫評分模件與數字病理軟件的圖像分析系統相結合)分別計算腫瘤中心和IM中CD3+、CD8+T細胞密度；利用SPSS軟件分析確定最佳臨界值以劃分高密度(記1分)和低密度(記0分)，最后計算分數總和，即免疫評分(分值范圍0～4分)[14]。為進一步優化該評分系統，將細胞密度轉化為四分位數，再計算其平均值，即免疫評分。該評分系統有兩種分類方法。在三分類評分系統中，0～25%、25%～70%、70%～100%分別為低、中、高免疫評分；二分類中，0～25%、25%～100%分別為低、高免疫評分。與二分類相比，三分類分組更詳細，似乎有利于準確評估患者預后。除了評估復發風險、指導治療決策外，免疫評分系統還具有重要的生物學意義，包括為新療法提供作用靶點，預測多種抗腫瘤治療方法療效等[15]。與傳統病理檢測技術相比，免疫評分系統的數字化病理技術對TIL的測定更加準確[3]。

3 免疫評分系統的價值

為了促進免疫評分在臨床實踐中的應用，在癌癥免疫治療協會的支持下，全球免疫評分聯盟(由全球13個國家和14個中心組成)對免疫評分的重復性、預測能力等進行驗證，其主要研究終點為復發時間(TTR)，次要研究終點為總生存期(OS)、無病生存期(DFS)等。2018年，有研究納入3 539份Ⅰ～Ⅲ期結腸癌樣本進行制片、染色，經過質控后排除858份，余下2 681份(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期分別占17%、54%、29%)被隨機分配至訓練集、內部驗證集和外部驗證集，然后利用免疫評分病理圖像分析儀得出其免疫評分。該研究結果顯示：在訓練集中，高、中、低免疫評分患者5年復發率分別為8%、19%、32%，5年OS率分別是82%、77%、62%，提示高免疫評分者有更低復發率、更長生存時間；在外部驗證集中，高、中、低免疫評分的3年復發率分別為14%、24%、36%；內部驗證集中也出現類似結果[16]。8位病理學專家隨機對5個中心的數據進行驗證，結果顯示重復性良好。因此，免疫評分被認為是結腸癌TTR、DFS和OS的重要預測因子。Cox回歸模型多因素分析顯示，免疫評分是TTR的獨立預后因素，且其預測患者OS的準確性優于TNM分期等因素。

研究表明，Ⅱ期結腸癌術后輔助化療整體獲益不高(≤5%)，因此對于術后是否需要進行輔助化療存在較大爭議[17]。目前，臨床醫生主要根據錯配修復蛋白功能狀態或微衛星不穩定狀態和臨床病理高危因素等將Ⅱ期結腸癌患者進行分組?！暗臀！苯M即錯配修復功能缺陷或微衛星高度不穩定型(MSI-H)且無臨床病理高危因素者，其預后通常較好，一般不推薦輔助化療；“高?！苯M即錯配修復功能完整或微衛星穩定型且具有臨床病理高危因素者，其預后不佳，通常建議行輔助化療。余下Ⅱ期患者即“中?！苯M，可選擇單藥化療或觀察[18]。然而實際上，一部分“高?！被颊卟⑽磸桶l，而一些“低危”患者卻出現了復發轉移。顯然，這種方法不能準確識別高危Ⅱ期患者。上述研究的亞組分析結果表明，免疫評分能更準確的識別高危Ⅱ期患者，使其從輔助化療中獲益，同時使低危Ⅱ期患者豁免輔助化療。此外，該研究還發現MSI-H與高免疫評分存在相關性，這可能與MSI-H腫瘤高水平抗原負荷誘導的強烈免疫反應有關。

此外，法國國際輔助化療持續時間評估(IDEA)隊列研究發現，在Ⅲ期結腸癌中，相較于3個月mFOLFOX(氟尿嘧啶/亞葉酸鈣+奧沙利鉑)治療，6個月療程更具優勢性[19]。在此基礎上，PAGES等評估了免疫評分在mFOLFOX6亞組中的預后價值，該研究結果公布在2020美國臨床腫瘤學會胃腸道腫瘤研討會會議上，即低、中高免疫評分的3年DFS率分別為66.34%和77.66%，低免疫評分者有更高的復發或死亡風險；在結合T/N分期的多變量分析中，免疫評分仍與其DFS獨立相關。該研究還發現免疫評分可指導Ⅲ結腸癌患者輔助化療療程，即相比于3個月療程，只有中、高IS者可從6個月mFOLFOX治療中獲益。另一項前瞻性臨床試驗顯示，600例接受術后mFOLFOX化療的Ⅲ期結腸癌患者進行免疫評分檢測，其高、低免疫評分者3年DFS分別為92%、78%[16]，與IDEA隊列研究一致。由此可見免疫評分可以優化Ⅲ期結腸癌患者的輔助治療決策。YOMODA等[20]也發現，高免疫評分的Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者具有較好預后，且免疫評分是OS和無復發生存率(RFS)的獨立預后因素。

4 免疫評分的探索

4.1預測其他疾病的預后 作為一個基于免疫功能的生物標記物，免疫評分具有可行性、簡單性和重復性等特點[21]。目前，免疫評分系統已在多種實體腫瘤的預后評估中取得進展[22]，包括黑色素瘤、胰腺癌[23]、膀胱癌[24]等。免疫反應作為機體應對各種刺激的一種防御反應，可以影響多種疾病的進展，包括腫瘤及非腫瘤性疾病。一項關于免疫評分預測非腫瘤性疾病生存時間的研究正在進行中，該研究指向高免疫細胞浸潤與更長的生存時間有關[22]。若其結果得到進一步驗證，免疫評分將廣泛應用于臨床為患者帶來獲益。

4.2預測抗腫瘤治療療效 免疫評分系統可用于預測多種抗腫瘤常規療法和新療法的治療療效。有研究發現，蒽環類、鉑類化療藥物及電離輻射通過激活機體免疫反應以達到最佳抗腫瘤治療效果[17]；直腸癌和乳腺癌良好的新輔助放化療療效與腫瘤內高CD3+、CD8+T細胞浸潤密切相關[25-26]。

近年來，免疫治療是抗腫瘤治療領域取得的最重大突破，成為繼手術、化療、放療和靶向治療后又一全新抗腫瘤治療方法，在治療多種晚期惡性腫瘤中獲得引人注目的臨床療效，主要包括T淋巴細胞過繼療法、腫瘤疫苗及免疫檢查點抑制劑等。其中，針對程序性死亡受體1(PD-1)及其配體(PD-L1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)的免疫檢查點抑制劑已經廣泛地應用于黑色素瘤、非小細胞肺癌、結直腸癌等多種實體腫瘤的一線或后線治療，為患者帶來長期生存獲益。然而其客觀有效率僅為10%～30%[27]，并且部分患者出現明顯不良反應[28]。因此，準確預測免疫治療療效、篩選適宜患者是一個重要的環節。目前，最常用的預測指標主要是PD-1/PD-L1表達狀態、微衛星不穩定性或錯配修復功能狀態。CHEN等[29]對接受抗CTLA-4序貫抗PD-1治療的患者進行研究發現，抗CTLA-4治療早期及序貫抗PD-1治療早期應答者的CD3+、CD8+T細胞密度高于無應答者，且治療過程中應答者CD8表達水平明顯提高。因此，治療早期評估腫瘤組織的免疫狀態具有更高的預后價值。有研究發現，黑色素瘤、結直腸癌等多種惡性腫瘤治療前組織活檢中CD8+、CD4+、PD-1+細胞浸潤密度與其治療反應密切相關[30-31]，并且預測Pembrolizumab治療Ⅲ期黑色素療效的最佳指標不是PD-1、PD-L1，而是腫瘤中心和IM中CD8+T細胞浸潤密度。其中，腫瘤內高CD8+T細胞浸潤是抗PD-1單抗激活抗腫瘤免疫反應的重要基礎?？傊?，免疫評分亦可作為一種預測抗腫瘤治療療效的標記物。

4.3結合其他指標或技術的探索 由于免疫組化可用型標記物的限制，CD3、CD8+T細胞浸潤密度未必能全面反映腫瘤局部免疫狀況。并且針對不同區域、不同種族人群可能需要結合TNM分期、MSI狀態等指標以完善該評分系統[32]。新西蘭的一項研究表明，將B淋巴細胞誘導蛋白-1納入免疫評分可進一步識別高?；颊遊33]。除了免疫因素外，腫瘤基質密度、間質區域面積等內在因素也具有重要的預后價值。REICHLING等[34]研發了一可以同時檢測上述因素的人工智能軟件。通過該軟件對腫瘤中心和IM中CD3+、CD8+T細胞密度進行評估，結果顯示，標準免疫評分預測RFS的能力未明顯優于單獨的腫瘤中心CD3+T細胞密度，而后者與腫瘤基質密度等相結合后明顯優于前者。JAN等[35]通過研究發現，與健康人相比，Ⅱ、Ⅲ期結直腸癌患者血管內皮生長因子、血漿轉化因子B1等抑制因子水平明顯升高，而CD8+T、CD4+T細胞和自然殺傷細胞等明顯減少。可進一步將其與免疫評分進行比較以探索循環免疫狀態與腫瘤局部免疫狀態之間的相關性，從而明確循環免疫狀態是否可以作為評估腫瘤預后、篩選高危患者的新工具[36]。將免疫評分與其他具有預后價值的指標或技術相結合，有望進一步提高腫瘤患者預后評估的準確性。

5 小結與展望

免疫評分評分系統是可重復的、穩定的，其在預測結腸癌患者預后、篩選高復發風險人群等方面具有重要價值。目前，免疫評分已被正式納入世界衛生組織《消化系統腫瘤(第5版)》和2020年歐洲臨床腫瘤協會指南，并且已被引入我國。推薦Ⅱ～Ⅲ期結腸癌患者進行免疫評分檢測，以輔助臨床醫生評估術后復發風險，指導治療決策的制定，但是目前尚未明確其二分類和三分類系統的優缺點。因此，該評分系統的標準尚待進一步細化。