PL-11多參數血小板功能分析儀與流式細胞術檢測血小板聚集功能的效果比較

陳永源，周伯榮，鐘廣宏，李曉瑩，高萬里，羅建華 (廣州醫科大學附屬第五醫院神經內科，廣東 廣州 510700)

抗血小板治療是心腦血管病患者重要的治療方法。如今抗血小板藥物已在臨床上廣泛使用，如何評價抗血小板藥物的療效及個體化治療已逐漸成為當今醫學上的熱點問題。血小板的聚集功能是血栓形成的重要因素[1]。血小板的聚集功能是目前臨床實踐中判斷血小板功能活化程度的金標準。血小板集聚功能檢測有諸多方法，主要的實驗室監測方法有光學法、電阻抗法、流式細胞術等，其中流式細胞術是通過測定血小板血管擴張劑刺激磷蛋白 (VASP ，Vasodilator-stimulated phospho-protein)磷酸化程度，計算出血小板反應指數(PRI，Platelet Response Index)。Montalescote等評價VASP是“ADP誘導的血小板P2Y12受體激活的最合理評價方法，是氯吡格雷藥物療效最具有特異性的監測指標”[2]。PL-11多參數血小板功能分析儀是一種最新的檢測血小板集聚功能的儀器，它采用全血連續檢測法對血小板計數并檢測血小板聚集功能。本研究主要對流式細胞術檢測VASP的磷酸化程度與PL-11多參數血小板功能分析儀使用連續血小板計數法在檢測血小板聚集功能方面的效果比較，評估流式細胞術檢測與連續血小板計數法在監測血小板聚集功能的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取 2015年我院就診的缺血性卒中患者95例，其中男63 例(66.32%)，女32例(33.86%)，平均年齡(65.68 ±10.24)歲。本研究由我院倫理委員會批準，所有入組患者均要簽署知情同意書。缺血性卒中診斷符合按中華醫學會神經病學分會2010 年版腦梗死(動脈粥樣硬化血栓形成)診斷標準，同時符合以下納入標準:①近1年來未發生急性腦梗死且NIHSS 評分在23 分以下的患者；②年齡45～85歲之間；③近2周來未服用以下藥物：氯吡格雷、阿司匹林等抗血小板藥物及他汀類降血脂藥物；④血小板計數處于正常范圍的患者。排除標準：①近期出現嚴重急性腦血管病的患者；②有嚴重肝病或慢性腎臟病的患者；③有房間隔缺損、房顫等心臟疾病的患者；④凝血功能障礙的病人或免疫系統疾病的患者；⑤近期有行手術的患者；⑥對氯吡格雷、阿司匹林、他汀類藥物不能耐受的患者；⑦近2周有服用質子泵抑制劑的患者。

1.2儀器與試劑：流式細胞儀(美國BD公司)，PGE1(前列腺素E1，法國BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，流式細胞儀試劑，法國BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，PL-11試劑，江蘇英諾華公司)。PL-11 血小板功能分析儀(由南京神州英諾華醫療科技有限公司提供 ) 及相關配套試劑(ADP，濃度為 50 mmol/L)。

1.3方法：

1.3.1記錄資料：記錄入組患者的各項生命體征，抽取靜脈血測定血常規、凝血功能指標、心肝腎功及電解質等指標。

1.3.2標本采集：所有入組患者服用氯吡格雷75 mg/d，服用1個月后均于清晨空腹狀態下采集入組者肘靜脈血 ：2管/人，用含3.8%枸櫞酸鈉真空采血管抽取，用于血小板VASP磷酸化檢測的靜脈血用含3.8%枸櫞酸鈉真空采血管抽取。標本保存在37 ℃的恒溫箱，在2 h內完成測驗,血小板VASP磷酸化檢測可48 h內完成檢測；檢測前不能出現凝集。

1.3.3檢測方法

1.3.3.1流式細胞術檢測血小板 VASP的磷酸化:VASP是細胞內的一種激動調節蛋白，參與血小板的聚集活化。在基礎狀態下VASP呈非磷酸化狀態，cAMP(環磷酸腺苷)可以通過相關反應使VASP磷酸化；患者血樣本與試劑 PGE1(前列腺素E1)或PGE1+ADP( 前列腺素E1+二磷酸腺苷)一起溫浴，當細胞經過透化作用后，一種特異性單克隆抗體(克隆16C2)可識別已經磷酸化的VASP ，這種特異性單克隆抗體(克隆16C2)可經過免疫熒光方法(非洗脫)被標記，經過這種間接免疫熒光方法，流式細胞儀可根據熒光的信號分析這兩種形式的磷酸化水平，評估每個血樣本的VASP被ADP 抑制的磷酸化活性，計算出血小板反應指數(PRI)。檢測時加入PGE1或PGE1 +ADP，測試管的熒光信號后，使用校正過的熒光強度均值(MFIc)計算PRI值。血小板反應指數(PRI)=[MFIc(PGE1)-MFIc(PGE1+ADP)]/MFIc(PGE1)×100%。PRI≥50%定義為血小板高反應性[3-4]，即氯吡格雷低反應性。

1.3.3.2PL-11多參數血小板多功能分析儀用連續計數檢測法原理(SPCM：Sequencing Platelet Counting Method)檢測血小板聚集功能：該儀器對加入ADP試劑前后患者血小板的數目進行連續計數，通過對比加入ADP前與加入后血小板數量的變化和血小板下降的速率，來評估血小板聚集功能。血小板最大聚集率(MAR)的結果(%)=(原始血小板數-聚集后血小板數)/原始血小板數×100%。根據英諾華公司提供的標準：最大血小板聚集率≥55% 為血小板高反應性，即氯吡格雷低反應性。

2 結果

2.1兩種方法結果的基本情況：PL-11血小板分析儀計算所得MAR最小值為6.30%，最大值為77.50%，平均(31.88±19.09)%，測得血小板高反應性例數為13例(13.68)；流式細胞術檢測的PRI最小值為7.00%，最大值為68.00%，平均值為(31.20±15.54)%，測得血小板高反應性例數為11例(11.58%)。血小板分析儀所檢測的MAR范圍高于PRI，見圖1。

圖1 兩種檢測結果比較

2.2兩種方法的相關性分析：有效觀察值個數數值為95，兩種檢測方法結果經相關性分析(r=0.898，P<0.001)，說明兩種檢測方法存在明顯相關，見圖2。

3 討論

缺血性腦卒中(ischemic stroke)的病死率高，嚴重影響患者的生活質量和預期壽命，可造成嚴重的社會經濟負擔[5]。抗血小板藥物是防治缺血性腦卒中的關鍵[6]。相關研究表明，氯吡格雷可有效地降低缺血性卒中患者主要不良心腦血管事件的發生概率[7]，但有一定數量的患者存在氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)，即氯吡格雷抑制血小板聚集功能的作用減弱，服用常規劑量氯吡格雷時，仍會出現嚴重的心腦血管不良事件，從而影響了患者受益[8]。對CR的檢測，關鍵在于血小板聚集功能檢測。目前測定血小板聚集率的方法和儀器種類較多。國外曾有研究結果提示VASP是評價ADP誘導的血小板P2Y12受體激活的最合理方法，也是氯吡格雷藥物療效最具有特異性的監測指標[2]。血小板血管擴張劑刺激磷蛋白(VASP)是細胞內的一種肌動調節蛋白，VASP通過磷酸化狀態參與血小板的聚集活化。VASP磷酸化時，血小板活性受到抑制，VASP去磷酸化時，可促進血小板活化。VASP的磷酸化靠cAMP(環磷酸腺苷)調節。當ADP與血小板膜上P2Y12受體結合后，可使cAMP合成減少，導致VASP去磷酸化，繼而促進血小板活化。而PGE1(前列腺素E1)可使cAMP合成增多，促進VASP磷酸化，從而抑制血小板的激活。氯吡格雷經體內代謝后形成的活性物可作用在血小板膜上的P2Y12受體，特異性阻斷P2Y12受體與ADP結合，從而抑制血小板活化。而且氯吡格雷活性物對基礎的VASP磷酸化及PGE1刺激的VASP磷酸化無影響,但明顯降低ADP對PGE1刺激 VASP磷酸化的抑制作用[9]。流式細胞儀可根據熒光的信號分析加入PGE1與PGE1 +ADP這兩種形式的磷酸化水平，根據公式，計算出血小板反應指數(PRI)。應用流式細胞儀檢測VASP具有以下優點檢測靈敏度、特異度較高，穩定性好,室溫下檢測前樣本可保存48 h，甚至高達72 h[10]。但其操作復雜、費用昂貴，難以應用于臨床。PL-11血小板分析儀是運用庫爾特原理的連續自動計數檢測方法[11]，通過直接對血標本中血小板數量在誘聚劑加入后的變化進行連續檢測，直接反應血小板聚集功能。作為新型檢測方法，具有成本低、操作簡便易行、復測方便、自動化、耗時短等優點。本研究分別通過流式細胞術VASP法和PL-11血小板分析儀檢測血小板聚集功能。結果表明，PL-11血小板分析儀檢測的結果與VASP法具有較好的相關性(r值=0.898)。研究提示兩種檢測方法的血小板聚集力分別為PL-11血小板分析儀的(31.88±19.09)%與流式細胞術VASP法的(31.20±15.54)%，使用流式細胞術VASP法的血小板聚集力的標準差較小，同時結合入組患者的血小板聚集率，考慮流式細胞術VASP法的穩定性較高，受影響因素較少。

綜上所述，PL-11血小板分析儀與流式細胞術VASP法在檢測血小板聚集功能時有較好的相關性，可用于臨床或實驗室使用的血小板功能檢測方法。