鐵死亡在骨肉瘤中的應用前景*

全樺紅 綜述，王靜成，李小磊，顏連啟 審校

(江蘇省蘇北人民醫院骨科，江蘇 揚州 225001)

骨肉瘤是最常見的原發性骨惡性腫瘤，常見于年輕人，5年生存率為60%～70%，肺轉移導致的病死率為30%～40%。骨肉瘤的常規治療方法為手術切除、化療和放療。然而，骨肉瘤患者的預后自化療以來，骨原性肉瘤的存活率在過去30年中無改變[1]。因此，開發新的改善骨肉瘤患者預后的治療方法對提高骨肉瘤患者生存率具有重要意義。近年來，有研究表明，促進細胞發生鐵死亡是一種很有前途的降低癌細胞耐藥性的方法。鐵死亡是一種新的非凋亡調控的細胞死亡方式，其特征是鐵依賴性的脂質氧化物異常蓄積，在治療癌癥特別是間質性腫瘤中顯示出巨大的應用前景[2-3]。體內外實驗發現，鐵死亡對退行性疾病相關的病理細胞死亡(如阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病和帕金森病)、卒中、腦出血、創傷性腦損傷、缺血再灌注損傷和哺乳動物腎臟退化及各種類型的腫瘤均有不同的生理效應[4]。鐵死亡可能替代已有細胞死亡途徑克服現有化療藥物的耐藥性，提供新的藥物靶點或與其他抗腫瘤藥物聯合作為輔助治療骨肉瘤[5-6]。在此，將鐵死亡對骨肉瘤癌的抗腫瘤作用及其作用機制綜述如下。

1 鐵死亡的發現

細胞死亡主要包括以下2種形式，分別為凋亡(也稱為程序性細胞死亡)和壞死(不受控制的細胞死亡)[7]。鐵死亡是2012年BRENT R.STOCKWELLl博士通過化學篩選發現的細胞死亡類型——細胞內鐵依賴的脂質過氧化物大量蓄積而引起的一種獨特的鐵依賴的非凋亡細胞死亡[8]。鐵死亡細胞具有獨特的形態和生物能量特征，包括線粒體萎縮、線粒體膜密度增加、線粒體嵴減少或消失，以及外線粒體膜破裂和細胞內各種氧化還原酶活性的缺失[9]。此外，作為細胞壞死關鍵的負調控因子的受體相互作用蛋白1/受體相互作用蛋白3或親環素對細胞發生鐵死亡過程無明顯的抑制，而細胞自噬抑制因子3-甲基嘌呤也并不調節這一細胞死亡過程[6]。其可由實驗化合物，如愛拉斯丁(Erastin)選擇性致死小分子3(RSL3)或臨床藥物，如磺胺嘧啶、索拉非尼和青蒿琥酯在癌細胞和某些正常細胞，如腎小管細胞、神經元、成纖維細胞和T細胞中誘導[7]。鐵死亡是一種全新的細胞死亡方式。此外，一系列小分子已被發現能在多種癌癥中促進癌細胞發生鐵死亡和促進癌細胞對化療藥物的敏感性，不同種類的器官、組織對鐵死亡似乎具有不同的效應[8-9]。

2 鐵死亡的分子機制

鐵死亡最初是在RAS基因突變癌細胞中被定義的[10-12]。2012年BRENT R.STOCKWELLl博士發現了2個結構不相關的小分子，分別名為Erastin和RSL3，其對致癌的RAS突變細胞系具有選擇性致死作用，并將其統稱為RAS選擇性致死(RSL)化合物[13-15]。然而，突變的RAS基因似乎對鐵死亡的發生并不是必不可少的，一些沒有RAS基因突變的癌癥類型對鐵死亡的誘導也很敏感。

2.1半胱氨酸合成谷胱甘肽(GSH)通路在鐵死亡啟動過程中起主導作用(Erastin誘導途徑) Erastin是在化學篩檢中發現的可誘導致癌RAS突變細胞系發生鐵死亡的小分子之一[6，16]。在Erastin誘導的鐵死亡過程中谷氨酸-半胱氨酸轉運體也被稱為X-C系統，是Erastin分子最重要的作用靶點，胱氨酸(細胞內半胱氨酸的主要形式)主要以1∶1的比例通過谷氨酸-胱氨酸轉運體轉入細胞內，然后在細胞內合成GSH和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)，細胞在保護自身免受氧化破壞過程中主要以GSH作為輔助因子，GPX4催化脂質過氧化物還原為醇類物質[17]。HAO等[18]在研究鐵死亡在胃癌細胞系中作用機制時發現，沉默半胱氨酸二氧酶1(CDO1)可抑制Erastin誘導的胃癌細胞鐵死亡。抑制CDO1可恢復細胞GSH水平，阻止活性氧(ROS)的生成，并降低脂質過氧化物的最終產物之一的丙二醛。此外，沉默CDO1在Erastin處理的細胞中可維持線粒體形態穩定。部分類型的細胞對Erastin誘導的鐵死亡具有抵抗性，可能是因為這些細胞可通過其他途徑獲得半胱氨酸。半胱酰胺-轉運RNA合成酶是一種細胞內消耗半胱氨酸進行蛋白質翻譯的酶，HAYANO等[19]在研究鐵死亡發生機制中發現，敲除半胱酰胺-轉運RNA合成酶的生成基因后顯著抑制了由Erastin引起的鐵死亡。值得注意的是，應用GSH合成酶抑制劑抑制后也能導致細胞發生鐵死亡[12-13，20]。Erastin誘導的鐵死亡主要通過抑制細胞膜轉鐵蛋白受體-1(TFR1)上的谷氨酸-胱氨酸轉運體系統，減少胱氨酸被轉入細胞內，GSH合成減少，GPX4催化活性降低，導致過氧化物積累從而促使細胞發生鐵死亡，也說明鐵死亡是一種全新的細胞死亡方式。

2.2GPX4失活是鐵依賴和脂質過氧化物積累的原因 一般而言，GPX4是鐵死亡機制的中心調節器，而GPX4活性的缺失是由2種不同的機制介導的。第1個機制是Erastin誘導的谷氨酸-胱氨酸轉運體系統被抑制后細胞內GSH大量被消耗，GPX4活性缺失，導致細胞內致死性脂質氧化產物(磷脂雙分子層被氧化破壞的產物)異常蓄積，最終引起細胞ROS穩態被破壞，細胞發生鐵死亡[21]。第2個機制是以GPX4為目標靶點。以RSL3通路機制為例，有研究表明，RSL3誘導的鐵死亡過程中細胞內GSH水平無明顯變化，與Erastin效應截然相反。但細胞內仍有大量脂質ROS的生成，表明脂質氧化存在于Erastin和RSL3 2條不一樣的通路。通過Erastin實驗對蛋白質組分析發現，GPX4是RSL3的直接靶點，通過與GPX4直接共價結合抑制GPX4的交流活性，導致脂質過氧化物的積累[22]。為進一步驗證，IMAI等[23]在實驗中同時敲除和過表達GPX4目的基因，分別得到2組細胞產生對鐵死亡敏感性和抗性增強等截然不同的結果，而被敲除目的基因的細胞組在分別用RSL3抑制劑和鐵螯合劑處理后均能出現鐵死亡抗性。相似的實驗結果也在SUI等[21]研究鐵死亡在結直腸癌的作用機制中出現，過表達GPX4抑制了RSL3處理引起的細胞鐵死亡，表明抑制GPX4可能是RSL3誘導的結直腸癌細胞鐵死亡的關鍵性決定因素。表明GPX4是由Erastin和RSL3誘導的鐵死亡中心調控因子，其中以RSL3通路為主。

2.3脂質氧化物和ROS的蓄積是鐵死亡的必要條件 脂質過氧化產物和多不飽和脂肪酸增加了膜的流動性，對原始生命適應環境非常重要，亞油酸和花生四烯酸等多鏈不飽和脂肪酸可被細胞內ROS氧化，導致脂質氧化分解產物的生成，刺激細胞發生RSL3誘導的鐵死亡[24-25]。酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4通過氧化細胞膜磷脂的作用驅動胞吞作用，由其激活的含有2種脂肪酰基的花生四烯基，即腎上腺素基被證明是線粒體(尤其是線粒體上的鐵死亡)的死亡信號[26]。在GPX4體內和體外的模型中只有一類磷脂酰乙醇胺被嚴格鑒定為誘導鐵死亡的脂質類型。與此同時，多鏈不飽和脂肪酸的過氧化作用被證明是導致鐵離子增多的主要原因。ROS是部分還原的含氧分子，包括超氧化物、過氧化物和自由基是細胞內信號傳導、抗感染和癌細胞凋亡的重要二級信使。過量ROS通過抗氧化劑(酶解和非酶解)解毒，并在超氧化物歧化酶(銅鋅超氧化物歧化酶、錳超氧化物歧化酶)、GPX和過氧化氫酶的催化下發生反應[27]。ROS生成和解毒速率的不平衡導致氧化應激和自由基的產生，從而破壞DNA、蛋白質和脂質。鐵是氧化還原活性金屬，可通過芬頓反應促進細胞內的ROS池，在芬頓反應中鐵催化過氧化氫的分解，生成羥基自由基。在鐵死亡中胱氨酸-谷氨酸反轉運蛋白失活和GSH降解導致鐵依賴的ROS積累，ROS的積累會消耗大量的GSH，從而降低GPX4活性[28]。

2.4鐵代謝是鐵死亡的重要特征 鐵作為酶發揮生物活性的重要組成部分，在DNA合成、代謝，細胞周期的連續性和血管再生等方面具有不可替代的作用。同時，嗜鐵是鐵死亡的一項基本屬性，在誘導細胞鐵死亡過程中鐵作為一個氧化還原劑，通過芬頓反應促進ROS的生成。再者幾乎所有脂質過氧化物均可被鐵螯合劑消耗[28-29]。在生理條件下，鐵最初在十二指腸系膜的腸腔內以二價鐵離子(Fe2+)被吸收進入腸上皮細胞，隨后以三價鐵離子(Fe3+)被釋放入體循環，最終通過膜上的TFR1受體進入細胞，參與細胞內各種生理化學反應。細胞內游離的Fe2+催化氫氧化氫形成和氫氧根，此反應以19世紀化學家亨利J.H.芬頓反應命名。有研究發現，芬頓反應和鐵依賴酶均能產生ROS，其能觸發氧化作用到鄰近的生物分子，如蛋白質、DNA和脂質[25]。因此，鐵螯合過程中細胞內鐵的消耗不僅影響了氧基的一種來源，而且可能影響了大多數依賴鐵的氧基來源。TFR1是一種跨膜糖蛋白同型二聚體，與Fe2+轉鐵蛋白結合，對鐵的吸收和細胞生長調節至關重要。有研究發現，與非腫瘤干細胞比較，膠質母細胞瘤干細胞(CSCs)表達的TFR1及其配體轉運蛋白水平更高。因此，CSCs對鐵的吸收增加，提示鐵死亡可能參與了CSCs的增殖和穩定[30]。其中調控TFR1和Fe2+轉鐵蛋白 mRNA被分別敲除后有效降低了Erastin誘導的細胞毒性。除增加鐵的吸收外，細胞還可通過調節鐵蛋白水平增加細胞內的鐵，將多余的鐵離子隔離儲存，使鐵離子在細胞內積聚，同時，防止鐵離子介導的自由基反應[31]。而且鐵蛋白在許多癌組織中存在過表達現象，包括乳腺癌、胰腺癌、肝細胞癌、霍奇金淋巴瘤、多形性膠質母細胞瘤等。相反通過鐵螯合劑減少細胞內鐵儲留可有效抑制鐵死亡的發生。熱休克蛋白-1通過在體內減少細胞內鐵和脂質氧化產生ROS而阻礙細胞死亡。SUN等[32]研究表明，熱休克蛋白-1 mRNA下調增強了鐵死亡誘導Erastin途徑的激活，表現出抗腫瘤活力。

3 鐵死亡與骨肉瘤現有研究成果

3.1TFR1通過抑制信號傳導與轉錄激活因子3/核因子紅系2相關因子2(Nrf2)/GPx4信號通路誘導鐵血癥增強骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性 LIU等[33]在骨肉瘤對順鉑的敏感性研究中發現，促進骨肉瘤細胞發生鐵死亡可增強靶細胞對順鉑的敏感性。進一步研究發現，使用鐵死亡激動劑、Erastin RSL3處理顯著順鉑耐藥株后鐵死亡負調控因子，如磷酸化的信號傳導與轉錄激活因子3(信號轉導因子和轉錄激活因子1)、Nrf2、GPx4蛋白水平顯著降低，細胞內鐵死亡標志性分子，如丙二醛、ROS、脂質氧化物的生成和對順鉑的敏感性顯著增加。同樣采用鐵死亡抑制劑處理非耐藥株后骨肉瘤細胞對順鉑的耐藥性增強。說明鐵死亡為體外減弱骨肉瘤對順鉑的耐藥性提供了新的途徑。

3.2TFR1是改善骨肉瘤患者的預后因素 WU等[34]報道了TFR1在骨肉瘤中高表達，并進一步證實了TFR1的高表達與腫瘤的組織學分級、分期和遠處轉移顯著相關。鐵代謝異常與細胞發生鐵死亡機制密切相關，而鐵穩態主要由鐵的吸收、利用和儲存平衡所維持。TFR1是鐵吸收的主要蛋白，TFR1的免疫組織化學染色結果提示，腫瘤患者癌細胞中有較高的鐵吸收率。近年來，有研究表明，TFR1在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、惡性膠質瘤等多種腫瘤中均有高表達，且患者預后較差[7]。TFR1在骨肉瘤組織中表達較高，且與骨肉瘤患者惡性程度相關。為TFR1有可能作為骨肉瘤新的治療靶點提供了一定的理論依據。

3.3超順磁氧化鐵顆粒的過吞作用在紡絲磁場作用下可增加人骨肉瘤細胞凋亡并觸發自噬性細胞死亡 超順磁性氧化鐵納米粒子(SPIONs)的毒性仍是一個重要的爭論話題，其機制尚不清楚。DU等[35]研究表明，過量SPIONs可誘導骨肉瘤細胞死亡，并且當與旋轉磁場(SMF)相結合時這種效應被增強了；實驗發現，過量SPIONs誘導ROS的生成，以及SPIONs和SMF聯合誘導生成過量的ROS；而且SPIONs處理的細胞中線粒體電位顯著降低，而聯合SMF組線粒體電位損失更大，ROS生成明顯高于凋亡率，提示細胞死亡方式不僅是凋亡；同時，透射電子顯微鏡分析結果顯示，SPIONs在線粒體周圍聚集，在SPIONs處理的細胞中有很多腫脹的線粒體，也是線粒體功能障礙的證據，說明實驗觀察到的細胞死亡可能源于線粒體功能障礙；有研究發現，非磁場作用下SPIONs處理的細胞能通過ROS誘導的細胞死亡，而SMF作用下的SPIONs處理的細胞經常發生自噬性細胞死亡和凋亡；最后，用瘤內注射的方法觀察了SPIONs對異種移植小鼠的影響，結果顯示，聯合SMF組可顯著降低小鼠腫瘤體積，延長小鼠壽命。SPIONs聯合SMF通過ROS途徑刺激癌細胞發生的死亡不是傳統意義的細胞凋亡或自噬，而是以細胞內脂質氧化物蓄積過多，線粒體膜的脂質雙分子層被氧化，膜的完整性、流動性、通透性被破壞，而鐵參與則進一步促進了脂質氧化物的形成誘導的細胞鐵死亡。

4 小 結

雖然通過促進細胞凋亡使細胞對抗癌藥物的敏感性有了一定程度的提高，但許多癌細胞對抗癌藥物仍表現出較強的耐藥性，其機制尚不明確，尤其是在臨床環境中。越來越多的文獻報道了癌細胞耐藥與抑制鐵死亡的關系，鐵死亡表型現已被報道在許多癌癥中存在，如乳腺癌、膠質母細胞瘤、前列腺癌及其他癌癥等。而越來越多的實驗證明，鐵死亡有效地抑制了癌癥細胞的增殖和轉移，且不同類型癌癥的敏感性不同，間質性腫瘤敏感性較強。

鐵是促進細胞增殖和維持正常細胞周期過程所必需的微量元素，而這些過程的促進在一定程度上支持了癌細胞對鐵的依賴性增強。鐵是產生氧化應激的必需物質，氧化應激是鐵死亡的特征，盡管鐵的確切作用仍是推測性的，但實驗已發現對順鉑耐藥的骨肉瘤細胞存在對鐵依賴的抑制，這種抑制可能是導致細胞對順鉑耐藥的原因，因此，骨肉瘤(和其他癌癥)生長和侵襲所需的鐵水平的提高可能是癌癥治療的致命弱點。

鐵死亡在骨肉瘤中具有非常重要的作用，STAT3/Nrf2信號的過度激活可能介導了順鉑耐骨肉瘤細胞抗氧化能力增強，通過抑制STAT3/Nrf2/GPx4信號通路誘導鐵死亡增強了骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性，TFR1抑制了骨肉瘤細胞的增殖和遠處轉移，大大改善了患者預后。因此，使用鐵離子誘導劑治療骨肉瘤，無論是單獨或與傳統療法相結合，鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式在一定意義上為癌癥的靶向治療提供了新的治療靶點。